ГОСТ 20264.3-81
Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса

ГОСТ 20264.3-81

Группа С09

     
     
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

Методы определения активности пектолитического комплекса

Enzyme preparations.
Methods for determination of pectolytic complex activity



МКС 07.100.30
65.120
ОКСТУ 9291

Дата введения 1982-07-01



Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 15 апреля 1981 г. N 1973 дата введения установлена 01.07.82

Ограничение срока действия снято по протоколу N 2-92 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 2-93)

ВЗАМЕН ГОСТ 20264.3-74

ИЗДАНИЕ с Изменением N 1, утвержденным в январе 1987 г. (ИУС 4-87).


Настоящий стандарт распространяется на ферментные препараты микробного происхождения и устанавливает методы определения активности пектолитического комплекса.

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ

1.1. Отбор проб - по ГОСТ 20264.0-74.

1.2. Все весовые определения проводятся на лабораторных весах общего назначения по ГОСТ 24104-88* 1 и 2-го классов точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г. Допускается применение других весов с аналогичными техническими и метрологическими характеристиками.

________________

* С 1 июля 2002 г. введен в действие ГОСТ 24104-2001.

(Введен дополнительно, Изм. N 1).

2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ПкС) (интерферометрический метод)

2.1. Сущность метода

Метод основан на определении пектолитических ферментов при каталитическом расщеплении пектина.

За единицу пектолитической активности должно быть принято количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г пектина до продуктов, не осаждаемых сернокислым цинком при проведении гидролиза в строго определенных условиях: температура 30 °С, время гидролиза 1 ч, величина рН реакционной среды 4,0; соотношение фермент-субстрат в реакционной среде, обеспечивающее гидролиз 30%-ного пектина, взятого на реакцию.

Пектолитическую активность выражают числом указанных единиц в 1 г испытуемого препарата.

Количество продуктов гидролиза пектина, не осаждаемых сернокислым цинком, определяют на интерферометре.

2.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Интерферометр типа ИТР-2 или ЛИР-2.

Мешалка любой марки.

Прибор для определения рН среды в интервале от 1 до 14 с погрешностью измерения не более 0,05 рН.

Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1% или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками.

Термометры 0-150 °С по ГОСТ 28498-90 с ценой деления 1 °С.

Пробирки стеклянные диаметром 15-18 мм по ГОСТ 25336-82.

Стаканчики для взвешивания вместимостью 25-30 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) по ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные 2-50, 500-2 (наливные) по ГОСТ 1770-74.

Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336-82 вместимостью 250, 300, 500 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1).

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76.

Фильтры обеззоленные. Синяя лента.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 35% и содержанием основного вещества не менее 70%.

Сахароза по ГОСТ 5833-75, раствор с массовой долей сахарозы 0,25%.

Цинк сернокислый по ГОСТ 4174-77, раствор с массовой долей сернокислого цинка 15%.

Аммиак водный по ГОСТ 3760-79.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.


(Измененная редакция, Изм. N 1).

2.3. Подготовка к анализу

2.3.1. Приготовление основного ферментного раствора из очищенных порошкообразных препаратов

0,1000 г (или 1,0000 г) исследуемого препарата взвешивают с погрешностью не более 0,0001 г в стаканчике вместимостью 25-30 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1). Навеску тщательно растирают стеклянной палочкой с небольшим количеством дистиллированной воды. Затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (500 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)), доводят водой до метки и перемешивают. С целью избежания адсорбции фермента на наполнителе необходимо процессы растворения и фильтрации проводить неразрывно: после растворения стандартизованных препаратов раствор сразу же фильтруют через беззольный фильтр. Из фильтрата отбирают определенное количество раствора в зависимости от активности препарата для проведения анализа в соответствии с табл.1.

Таблица 1

Количество ед. активности в 1 г препарата (ед. ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1))

Количество раствора, которое необходимо для вторичного разбавления, смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)

Объем, до которого необходимо разбавить взятое количество раствора, смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)

Количество препарата, содержащееся в 10 мл ферментного раствора, взятое на анализ, г

2-5

Без разведения

Без разведения

0,02

5-10

20

50

0,008

10-20

10

50

0,004

20-40

5

50

0,002

40-100

2,5

50

0,001

100-200

2,5

100

0,0005

200-500

2,5

250

0,0002


2.3.2. Приготовление основного ферментного раствора из поверхностной культуры гриба

1,00 г измельченной воздушно-сухой культуры гриба взвешивают с погрешностью не более 0,01 г, переносят в стакан вместимостью 250 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1), заливают 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) дистиллированной воды и выдерживают в течение 1 ч при 30 °С при периодическом перемешивании. Полученный ферментный экстракт фильтруют через бумажный фильтр и из фильтрата, в зависимости от активности культуры, в соответствии с табл.2 отбирают определенное количество в колбу вместимостью 50 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) и доводят водой до метки. Содержимое перемешивают и используют для определения пектолитической активности.

Таблица 2

Количество условных единиц активности в 1 г культуры

Количество фильтрата вытяжки, взятое для разбавления, смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)

Количество культуры, содержащееся в 10 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) ферментного раствора, взятое на анализ, г

0,4-1,0

-

0,1

1,0-2,5

20

0,04

2,5-5,0

10

0,02

5,0-10

5

0,01

Свыше 10

2,5

0,005


2.3.3. Приготовление раствора с массовой долей пектина 1% (субстрат)

Навеску пектина, взятую с таким расчетом, чтобы в 250 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора было 2,5 г чистого пектина (см. обязательное приложение), тонкой струей всыпают при непрерывном перемешивании на мешалке в коническую колбу вместимостью 300 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1), куда предварительно наливают около 130 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) дистиллированной воды. Раствор перемешивают в течение 3 ч на мешалке при комнатной температуре. По истечении этого времени в раствор добавляют при перемешивании определенное количество концентрированного раствора аммиака для установления рН 4,0. Затем объем раствора доводят дистиллированной водой до 250 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1), тщательно перемешивают и фильтруют через два слоя марли.

Раствор пектина готовят не менее чем за 4 ч до проведения анализа.

Раствор пектина можно использовать в течение 2-3 сут при условии хранения в холодильнике.

2.3.4. Проверка интерферометра

Интерферометр проверяют раствором сахарозы. В правую секцию кюветы интерферометра с длиной грани 4 см наливают дистиллированную воду, в левую - приготовленный раствор сахарозы.

Поправочный коэффициент (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)) вычисляют по формуле

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1),


где 780 - показание прибора;


ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - показание прибора при проверке раствором сахарозы.

2.4. Проведение анализа

Для анализа берут несколько пробирок диаметром 2 см и высотой 18 см по количеству исследуемых проб. В каждую пробирку наливают по 20 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) субстрата и ставят их в термостат с температурой (30±0,2) °С. В термостате пробирки выдерживают в течение 10 мин для того, чтобы растворы приняли постоянную температуру. Затем наливают в каждую по 10 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) испытуемого ферментного раствора, предварительно подогретого до 30 °С, содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают и оставляют в термостате при 30 °С на 1 ч для проведения гидролиза.

По истечении этого времени в пробирки с реакционной смесью добавляют по 2 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора сернокислого цинка для инактивации фермента и осаждения продуктов гидролиза и вынимают из термостата.

Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают путем встряхивания не менее 10 раз и фильтруют через фильтр.

Если фильтрат будет мутным, то его необходимо заново профильтровать через тот же фильтр до получения прозрачного раствора. Полученный раствор является исследуемым.

Одновременно готовят контрольный раствор. Для этого в пробирку наливают 2 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора сернокислого цинка, 10 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) исследуемого ферментного раствора и 20 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) субстрата.

Измерение проводят на интерферометре. Для этого исследуемый раствор наливают в левое отделение кюветы интерферометра с длиной грани 4 см, а контрольный раствор в правое отделение и измеряют величину смещения интерференционных полос, возникающую вследствие различия показателей преломления контрольного и исследуемого растворов. Отсчет ведут по шкале барабана прибора.

Для обеспечения точности анализа необходимо разведение ферментных препаратов подбирать таким образом, чтобы получать показания прибора от 400 до 1250

2.5. Обработка результатов

Пектолитическую активность (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)) в ед/г вычисляют по формуле

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1),


где ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - показание прибора для данного разведения;


ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - масса ферментного препарата, содержащегося в 10 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) ферментного раствора, взятого на определение, г;

0,06425, 19,62 и 1000 - постоянные коэффициенты, полученные при математической обработке экспериментальных данных по изучению зависимости между количеством образующихся продуктов гидролиза пектина в условиях метода и количеством единиц активности фермента, взятого на анализ;

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - поправочный коэффициент.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями активностей не должно превышать 5%.

Результат округляют до первого десятичного знака.

Предел возможных значений погрешности измерений пектолитической активности при доверительной вероятности ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)0,95 составляет 2,5%.

2.3.1-2.5. (Измененная редакция, Изм. N 1).

3. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКЗОПОЛИГАЛАКТУРОНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (экзо-ПгС) ПО УВЕЛИЧЕНИЮ КОЛИЧЕСТВА ВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ АЛЬДЕГИДНЫХ ГРУПП

3.1. Сущность метода

Метод основан на учете количества прогидролизированных связей по увеличению конечных альдегидных групп.

За единицу экзополигалактуроназной активности принято количество фермента, которое в условиях определения при 30 °С катализирует гидролиз 1 мкэкв. гликозидных связей в молекуле пектовой кислоты за 1 мин.

Экзополигалактуроназная активность выражается числом указанных единиц в 1 г препарата (или 1 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора).

3.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Шкаф сушильный вакуумный любой марки.

Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1% или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками.

Прибор для определения рН среды в интервале от 1 до 14 с погрешностью измерения не более 0,05 рН.

Воронка Бюхнера.

Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336-82 вместимостью 100, 500, 1000 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1).

Термометры 0-150 °С по ГОСТ 28498-90 с ценой деления 1 °С.

Бюретки любого исполнения, 2-го класса точности вместимостью 25 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) по ГОСТ 29251-91.

Пипетки 2-1-10 и 2-1-25 по ГОСТ 29227-91.

Бязь по ГОСТ 29298-92*.
_________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 29298-2005. - Примечание изготовителя базы данных.

Марля медицинская по ГОСТ 9412-93.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026-76.

Сито из проволочной сетки N 025 по ГОСТ 6613-86.

Кислота пектовая.

Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300-87.

Натрий серноватистокислый по ГОСТ 27068-86.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 35% и содержанием основного вещества не менее 70%.

Крахмал растворимый по ГОСТ 10163-76, раствор с массовой долей крахмала 1%.

Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, раствор молярной концентрации 1 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1).

Йод по ГОСТ 4159-79, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1).

Кислота серная по ГОСТ 4204-77, раствор молярной концентрации 2 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1).

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.

Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, раствор молярной концентрации 0,5 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1).

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.


(Измененная редакция, Изм. N 1).

3.3. Подготовка к анализу

3.3.1. Приготовление пектовой кислоты (субстрат)

30,00 г свекловичного пектина, взвешенного с погрешностью не более 0,01 г, заливают 600 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) дистиллированной воды для набухания и растворения, оставляют в холодильнике на ночь. Затем к раствору пектина прибавляют 300 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0,5 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (0,5 н.) для полного растворения пектина и снижения вязкости. Раствор фильтруют на воронке Бюхнера через два слоя марли, между которыми проложен слой ваты, и к фильтрату прибавляют еще 300 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора гидроокиси натрия молярной концентрации 0,5 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (0,5 н.)

Для омыления раствор оставляют на 1 ч в холодильнике. Затем осаждают пектовую кислоту прибавлением примерно 900 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) соляной кислоты. Выпавшую пектовую кислоту сразу же отжимают через бязь, помещают в стакан, заливают 70%-ным этиловым спиртом, тщательно перемешивают, растирая комки, и фильтруют на воронке Бюхнера через бязь. Промывают на воронке сначала 70%-ным этиловым спиртом до отсутствия ионов хлора, а затем 50 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) 96%-ным этиловым спиртом.

Полученную кислоту сушат на воздухе, затем в вакуумном сушильном шкафу при комнатной температуре.

Порошок отсеивают через сито с ячейками 0,25 мм (остаток на сите отбрасывают). Влажность продукта обычно 10-15%

3.3.2. Приготовление раствора с массовой долей пектовой кислоты 1%

Навеску пектовой кислоты, взятую с таким расчетом, чтобы в 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора был 1,0000 г пектовой кислоты, взвешивают с погрешностью не более 0,0001 г, медленно всыпают при тщательном перемешивании в стакан с дистиллированной водой и из бюретки по каплям при перемешивании добавляют раствор гидроокиси натрия молярной концентрации 1 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (1 н.) для доведения раствора до рН 4,0.

Полученный раствор пектовой кислоты количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1), доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают и фильтруют через два слоя марли на воронке Бюхнера. Раствор используют в день приготовления.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

3.3.3. Приготовление основного раствора ферментного препарата - по пп.2.3.1, 2.3.2 непосредственно перед применением.

3.4. Проведение анализа

3.4.1. 10 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора с массовой долей пектовой кислоты 1% вносят в колбу вместимостью по 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) и помещают в термостат с температурой 30 °С (303 К).

Через 10 мин в колбу вводят по 5 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) ферментного раствора соответствующего разведения, растворы тщательно перемешивают, отмечают время и оставляют на 10, 20, 30 или 60 мин (в зависимости от ферментативной активности) для проведения гидролиза.

По истечении этого времени в эти же колбы добавляют по 1,8 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора углекислого натрия и по 10 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора йода.

3.4.2. Для проведения анализа ферментных препаратов, величина активности которых неизвестна, необходимо взять 50 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора субстрата и от 1 до 25 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) ферментного раствора (общий объем реакционной смеси 75 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)). Из этой реакционной смеси каждые 5-10 мин отбирают пробы по 15 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) в колбы, куда предварительно налито 1,8 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора углекислого натрия.

3.4.3. Растворы тщательно перемешивают, закрывают стеклянными пробками и оставляют стоять 20 мин в защищенном от света месте. Затем вводят 2 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора серной кислоты, интенсивно перемешивают и оттитровывают избыток йода раствора серноватистокислого натрия молярной концентрации 0,025 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (0,05 н.) в присутствии крахмала, а результаты титрования выражают в смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора серноватистокислого натрия молярной концентрации 0,05 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (0,1 н.).

Одновременно ставят контрольный опыт с таким же количеством всех реагентов, только ферментный раствор вводят после добавления углекислого натрия непосредственно перед добавлением раствора йода.

Разность при титровании между контролем и опытом должна быть от 0,5 до 2,5 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1).

3.5. Обработка результатов

Экзополигалактуроназную активность (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)) в ед/г вычисляют по формуле

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1),


где 51,3 - число микроэквивалентов альдегидных групп, соответствующих 1 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора йода (или гипосульфита);

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - количество раствора йода, израсходованное на окисление образовавшихся при гидролизе альдегидных групп (находят по удвоенной разности титрований раствором серноватистокислого натрия молярной концентрации 0,025 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (0,05 н.) контрольной и опытной проб), смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1);

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - время гидролиза, мин;

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - количество препарата в пробе, израсходованное на титрование, г.

Для обеспечения точности анализа необходимо разведение ферментных препаратов подбирать таким образом, чтобы гидролиз пектовой кислоты не превышал 20%.

Гидролиз пектовой кислоты (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)) в процентах вычисляют по формуле

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1),


где ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - количество раствора йода, израсходованное на окисление образовавшихся при гидролизе альдегидных групп, смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1);

9,03 - количество пектовой кислоты, соответствующее 1 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора йода, мг;

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - количество пектовой кислоты в реакционной смеси, мг;

100 - коэффициент перевода в проценты.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями активностей не должно превышать 5%.

Результат округляют до первого десятичного знака.

Предел возможных значений погрешности измерений экзополигалактуроназной активности при доверительной вероятности ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)0,95 составляет 5%.

3.4.1-3.5. (Измененная редакция, Изм. N 1).

Разд.4. (Исключен, Изм. N 1).

5. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТИНЭСТЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (ПэС)

5.1. Сущность метода

Метод основан на гидролизе раствора пектина исследуемым ферментным препаратом с последующим определением освободившихся в результате гидролиза карбоксильных групп.

Пектинэстеразная активность характеризует способность фермента катализировать гидролиз сложноэфирных связей в молекуле пектина с образованием метилового спирта и свободных карбоксильных групп.

За единицу активности пектинэстеразы принято количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 мкэкв сложноэфирных связей в молекуле пектина за 1 мин при 30 °С.

Пектинэстеразную активность (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)) выражают числом указанных единиц в 1 г (или 1 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)) исследуемого препарата.

Определяемая величина пектинэстеразной активности находится в непосредственной зависимости от степени этерификации пектина.

Сравнимые результаты при работе с различными субстратами можно получить только при пересчете полученных данных на субстрат со 100%-ной степенью метоксилирования.

5.2. Аппаратура, материалы, реактивы

Прибор для определения рН среды в интервале от 1 до 14 с погрешностью измерения не более 0,05 рН.

Мешалка любой марки.

Ультратермостат типа ТС-16А с пределом измерений 40 °С и погрешностью 1% или другой ультратермостат с аналогичными характеристиками.

Воронка Бюхнера.

Стаканчики для взвешивания вместимостью 25-30 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) по ГОСТ 25336-82.

Стаканы и колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336-82 вместимостью 50, 200, 250, 300 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1).

Колбы мерные 2-50, 100-2 (наливные) по ГОСТ 1770-74.

Пипетка 2-1-10, 20, 100 по ГОСТ 29227-91.

Микробюретка.

Марля медицинская по ГОСТ 9412-93.

Баня водяная.

Вата медицинская по ГОСТ 5556-81.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 80% и содержанием пектина не менее 70%.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (0,1 н.).

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.


(Измененная редакция, Изм. N 1).

5.3. Подготовка к анализу

5.3.1. Приготовление раствора с массовой долей пектина 1% (субстрат)

Навеску пектина, взятую с таким расчетом, чтобы в 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора был 1,0000 г пектина (см. приложение), взвешивают с погрешностью не более 0,0001 г. Затем медленно всыпают при непрерывном перемешивании на мешалке в стакан с 70 мл дистиллированной воды и оставляют на 2 ч при комнатной температуре для набухания и растворения, после чего помещают на ночь в холодильник.

На следующий день раствор нагревают до 20 °С, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1), доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и фильтруют через два слоя марли с ватой на воронке Бюхнера. Раствор можно использовать в течение 2 сут при условии его хранения в холодильнике.

5.3.2. Приготовление основного раствора ферментного препарата из очищенных порошкообразных препаратов

0,5000 г исследуемого ферментного препарата взвешивают на аналитических весах с погрешностью не более 0,0001 г, тщательно растирают стеклянной палочкой в небольшом количестве дистиллированной воды, затем количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) и объем раствора доводят до метки дистиллированной водой. Раствор фильтруют и используют в день приготовления.

5.3.3. Приготовление основного раствора ферментного препарата из поверхностной культуры гриба

5,00 г измельченной культуры гриба, взвешенной с погрешностью не более 0,01 г, помещают в колбу вместимостью 200-300 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1), приливают пипеткой 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) дистиллированной воды и настаивают 1 ч при комнатной температуре, перемешивая через каждые 10 мин, затем раствор фильтруют через складчатый фильтр.

5.3.1-5.3.3. (Измененная редакция, Изм. N 1).

5.3.4. Приготовление инактивированного ферментного раствора

Для инактивации фермента, применяемого в контрольном опыте, берут 25 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) основного ферментного раствора, помещают его в колбу вместимостью 50 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1), закрывают пробкой с воздушным холодильником и выдерживают в кипящей водяной бане 1 ч.

5.4. Проведение анализа

В стаканы вместимостью по 50 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) помещают по 20 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора пектина, накрывают часовым стеклом и ставят с промежутками в 15 мин в термостат при температуре 30 °С. Через 15 мин в два стакана прибавляют по 10 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) ферментного раствора, а в другие по 10 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора инактивированного фермента.

Общий объем реакционной смеси всегда равен 30 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1). Если для анализа берут менее 10 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) ферментного раствора, то недостающий объем дополняют дистиллированной водой, которую вводят перед добавлением ферментного раствора.

Через час после введения фермента пробу вынимают из термостата и быстро титруют из микробюретки раствором гидроокиси натрия до рН 7,5, используя для этой цели потенциометр. Разность между контролем и опытом при титровании должна быть от 0,5 до 1,5.

5.5. Обработка результатов

Пектинэстеразную активность (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)) в ед/г вычисляют по формуле

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1),


где ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - количество раствора гидроокиси натрия, необходимое для титрования освободившихся в результате действия фермента карбоксильных групп (находят по разности между количеством гидроокиси натрия, израсходованным на титрование опытного и контрольного растворов), смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1);

100 - число микроэквивалентов прогидролизованных сложноэфирных связей, соответствующее 1 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) 0,1 н. раствора гидроокиси натрия;

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - время гидролиза, мин;

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - масса ферментного препарата, взятого для испытания, г;

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - степень этерификации пектина, используемого в качестве субстрата;

100 - степень этерификации пектина, на которой ведется расчет.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение активностей, полученных при анализе двух навесок. Из каждой навески делают не менее трех разведений. Допускаемое расхождение между значениями активностей не должно превышать 5%.

Результат округляют до первого десятичного знака.

Предел возможных значений погрешности измерений пектинэстеразной активности при доверительной вероятности ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)0,95 составляет 5%.

ПРИЛОЖЕНИЕ (обязательное). МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕКТИНА (кальцийпектатный метод)

ПРИЛОЖЕНИЕ
Обязательное

1. Сущность метода


Метод основан на получении соли пектана кальция в виде осадка.

2. Аппаратура, материалы, реактивы


Шкаф сушильный любой марки, обеспечивающий нагрев до 105 °С.

Мешалка любой марки.

Эксикатор по ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные 1-100-2 или 2-100-2 (наливные) по ГОСТ 1770-74.

Пипетка 2-1-20 по ГОСТ 29227-91.

Цилиндр любого исполнения вместимостью 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) по ГОСТ 1770-74.

Стаканчики для взвешивания любого типа вместимостью 25-30 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) по ГОСТ 25336-82.

Фильтры обеззоленные. Синяя лента.

Пектин свекловичный со степенью метоксилирования не менее 30% и содержанием основного вещества не менее 70%.

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (0,1 н.).

Кислота уксусная по ГОСТ 61-75, раствор молярной концентрации 0,1 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (1 н.).

Кальций хлористый по ГОСТ 4161-77, раствор молярной концентрации 1 моль/дмГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) (2 н.).

Серебро азотнокислое по ГОСТ 1277-75, раствор с массовой долей серебра 1%.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Примечание. Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.


(Измененная редакция, Изм. N 1).

3. Проведение анализа


0,150 г исследуемого свекловичного пектина, взвешенного на аналитических весах с погрешностью не более 0,002 г, растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды при постоянном перемешивании на мешалке, затем количественно переносят в колбу вместимостью 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1), доводят дистиллированной водой до метки и оставляют до получения однородного раствора.

Затем берут 20 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) этого раствора в колбу и к ним прибавляют 100 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора гидроокиси натрия. Смесь для полного омыления пектина в пектовую кислоту оставляют на 7 ч (можно на ночь). Затем прибавляют 50 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) 1 н. раствора уксусной кислоты, а через 5 мин 50 смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) раствора хлористого кальция и оставляют на 1 ч.

После этого раствор кипятят 5 мин и фильтруют через обеззоленный фильтр, высушенный до постоянной массы. Осадок пектата кальция промывают горячей дистиллированной водой до исчезновения ионов хлора (реакция с раствором азотнокислого серебра).

После промывки осадок с фильтра помещают в бюксу и высушивают при 105 °С до постоянной массы.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

4. Обработка результатов


Количество пектина (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)) в граммах, взятое на омыление, вычисляют по формуле

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1),


где ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - масса пектина, взятая для приготовления раствора, г;

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - объем исходного раствора пектина, смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1);

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - объем пектина, взятый на омыление, смГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1).

По разности масс между фильтром и осадком и фильтром без осадка определяют содержание пектата кальция.

Массовую долю пектина (ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1)) в процентах вычисляют по формуле

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1),


где ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - масса осадка пектата кальция, г;

ГОСТ 20264.3-81 Препараты ферментные. Методы определения активности пектолитического комплекса (с Изменением N 1) - количество пектина, взятого на омыление, г;

0,92 - пересчетный коэффициент, учитывающий содержание кальция в осадке;

100 - переводной коэффициент для выражения результатов, %.

За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение пектина, полученное при анализе трех навесок пектина, допускаемое расхождение между ними не должно превышать 5%.

Результат округляют до второго десятичного знака.

(Измененная редакция, Изм. N 1).


Последние документы

Copyright © 2018