ГОСТ Р 52347-2005 - Комбикорма, комбикормовое сырье. Определение содержания аминокислот (лизина, метионина, треонина, цистина и триптофана) методом капиллярного электрофореза

ГОСТ Р 52347-2005

Группа С19

ОКС 65.120
ОКСТУ 9209

Дата введения 2006-07-01

Задачи, основные принципы и правила проведения работ по национальной стандартизации в Российской Федерации установлены ГОСТ Р 1.0-92 "Государственная система стандартизации Российской Федерации. Основные положения" и ГОСТ Р 1.2-92 "Государственная система стандартизации Российской Федерации. Порядок разработки государственных стандартов"

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (ОАО "ВНИИКП"), Научно-производственной фирмой аналитического приборостроения "Люмэкс" (НПФ АП "Люмэкс"), Федеральным государственным учреждением "Ленинградской межобластной ветеринарной лабораторией" (ФГУ ЛМВЛ)

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 31 мая 2005 г. N 136-ст

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе "Национальные стандарты", а текст этих изменений - в информационных указателях "Национальные стандарты". В случаях пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе "Национальные стандарты"

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на комбикорма и комбикормовое сырье и устанавливает экспрессный метод определения содержания аминокислот: лизина, метионина, треонина, цистина и триптофана с помощью капиллярного электрофореза.

Метод основан на разделении в кварцевом капилляре под действием электрического поля ионных форм аминокислот и на их детектировании по собственному поглощению в ультрафиолетовой (УФ) области.

Идентификацию и количественное определение анализируемых аминокислот проводят с помощью установленного программного обеспечения.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 4107-78 Бария гидроокись 8-водная. Технические условия

ГОСТ 4199-76 Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия

ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 10521-78 Кислота бензойная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 13979.0-86 Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 17083-87 Электротепловентиляторы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 17681-82 Мука животного происхождения. Методы испытаний

ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия

ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 27262-87 Корма растительного происхождения. Метод отбора проб

ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498-98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Диапазоны измерений содержания аминокислот и метрологические характеристики метода

Диапазоны измерений содержания аминокислот (АК) и значения показателей повторяемости, воспроизводимости и точности приведены в табл.1 (при вероятности =0,95).

Таблица 1

Наименование определяемого компонента и диапазон измерений	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратичное отклонение повторяемости) , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратичное отклонение воспроизводимости) , %	Показатель точности (границы относительной погрешности) , %
Лизин, г/дм:
от 0,25 до 1 ,0 включ.	20	25	50
" 2,5 "	15	20	40
" 2,5 " 10 "	10	14	28
Метионин, г/дм:
от 0,3 до 1,0 включ.	20	25	50
" 3,0 "	15	20	40
Треонин, г/дм:
от 0,25 до 1,0 включ.	20	25	50
" 3,0 "	15	18	36
Цистин, г/дм:
от 0,2 до 2,0 включ.	20	25	50
Триптофан, г/дм:
от 0,1 до 2,0 включ.	11	15	30

4 Требования техники безопасности

4.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004, ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019.

4.2 Помещение, в котором проводится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с реактивами необходимо проводить в вытяжном шкафу.

4.3 При работе с концентрированными кислотами и щелочами необходимо использовать резиновые перчатки.

5 Отбор и подготовка проб к выполнению измерений

5.1 Отбор проб - по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13979.0, ГОСТ 17681, ГОСТ 27262, ГОСТ 27668.

5.2 Подготовка пробы к анализу - по ГОСТ Р 51419 с использованием сита с отверстиями диаметром 1 мм.

6 Определение содержания лизина, метионина, треонина и цистина

6.1 Средства измерений, оборудование, материалы и реактивы

Система капиллярного электрофореза с диапазоном изменения рабочего напряжения от 1 до 25 кВ, системой поддержания рабочей температуры капилляра, спектрофотометрическим детектором, предназначенным для регистрации оптического поглощения в области 190-200 нм, снабженная кварцевым капилляром (эффективная длина 65 см, внутренний диаметр 0,05 мм), типа "Капель-105" по [1].

Программно-аппаратный комплекс для сбора и обработки хроматографических данных типа "МультиХром для Windows", версия не ниже 1.5.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,001 г и ±0,02 г.

Холодильник бытовой по ГОСТ 16317 любой марки.

рН-метр лабораторный (основная погрешность измерения не более ±0,05 единиц рН).

Центрифуга лабораторная марки ШХ 2.779.040 со скоростью вращения не менее 6000 об/мин.

Шкаф сушильный лабораторный с терморегулятором, обеспечивающим поддержание температуры (110±2) °С.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.

Вентилятор по ГОСТ 17083.

Эксикатор по ГОСТ 25336.

Баня водяная с регулятором нагрева.

Бутыли из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой вместимостью 10, 20, 100, 500 и 1000 см.

Колбы конические со шлифом К-1-25(1000)-14/23(19/26, 24/29) по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 1(2)-25(50, 100, 1000)-2 по ГОСТ 1770.

Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-2-1(5, 10) по ГОСТ 29227.

Пипетки с одной отметкой 1(2)-2-1(5, 10, 20) по ГОСТ 29169.

Микродозаторы переменного объема 5-50 мм, 50-200 мм, 200-1000 мм и пределом допускаемой погрешности измерения не более ±5% по [2].

Пробирки П2Т-25ТС по ГОСТ 25336.

Пробирки для микропроб однократного применения (типа Эппендорфа) вместимостью 1,5 см по [3].

Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8 (19/9, 24/10, 34/12) по ГОСТ 25336.

Воронки В-25(36)-36(80) ХС по ГОСТ 25336.

Ампулы стеклянные с перетяжкой вместимостью 20 см из стекла по ГОСТ 21400.

Виалы стеклянные с герметично завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см для кислотного гидролиза.

Фильтры целлюлозно-ацетатные, размер пор 0,2 мкм, диаметр 25 мм.

Фильтры обеззоленные "синяя лента" по [4].

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор молярной концентрации (NaOH)=0,5 моль/дм.

L-лизин моногидрохлорид, L-метионин, L-цистин, L-треонин, L-аргинин квалификации не ниже "ч.", "Флука", Швейцария. (Допускается использовать D-, а также смесь DL-аминокислот).

Кислота соляная по ГОСТ 3118, растворы молярных концентраций (HCI)=1 моль/дм, (HCI)=0,1 моль/дм, (HCI)=6 моль/дм.

-циклодекстрин, "Флука", Швейцария.

Натрий тетраборнокислый, стандарт-титр [5].

Натрий тетраборнокислый 10-водный по ГОСТ 4199, растворы молярных концентраций (NaBO·10HO)=0,05 моль/дм и (NaBO·10HO)=0,02 моль/дм.

Кислота бензойная по ГОСТ 10521.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1 Допускается применение средств измерений и оборудования с такими же или лучшими метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

3 Требования к обработке посуды и использованию оснастки, необходимой для выполнения измерений, в соотве

тствии с приложением А.

6.2 Подготовка к проведению измерений

6.2.1 Приготовление вспомогательных растворов

6.2.1.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации (HCI)=1 моль/дм

8,3 см концентрированной соляной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Возможно использование стандарт-титра соляной кислоты. Срок хранения не ограничен.

6.2.1.2 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации (NaOH)=0,5 моль/дм

Навеску гидроокиси натрия массой 2,000 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в 50-60 см дистиллированной воды и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой. Раствор хранят в емкости из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой не более 2 мес.

Растворы по 6.2.1.1 и 6.2.1.2 предназначены только для промывок капилляра.

6.2.1.3 Приготовление раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации (NaBO·10HO)=0,05 моль/дм.

Раствор готовят из стандарт-титра по прилагаемой к нему инструкции и хранят в полиэтиленовой посуде, закрыв пробкой. Срок хранения раствора - 2 мес.

Примечание - При отсутствии стандарт-титра раствор готовят из 10-водного тетраборнокислого натрия. Для этого навеску препарата массой 19,071 г растворяют в мерной колбе вместимостью 1 дм в свежепрокипяченной и охлажденной без доступа воздуха дистиллированной воде. рН раствора при 20 °С должен быть 9,22±0,10.

6.2.1.4 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации (HCI)=6 моль/дм

100 см концентрированной соляной кислоты смешивают с равным объемом дистиллированной воды. Срок хранения не ограничен. Раствор используют для гидролиза проб.

6.2.1.5 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации (HCI)=0,1 моль/дм

Раствор готовят из стандарт-титра по прилагаемой к нему инструкции. Срок хранения не ограничен.

6.2.2 Приготовление буферных растворов

6.2.2.1 Приготовление рабочего буферного раствора молярной концентрации тетраборнокислого натрия (NaBO·10HO)=0,02 моль/дм

20 см раствора тетраборнокислого натрия, приготовленного по 6.2.1.3, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см и доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают и используют:

- для кондиционирования капилляра;

- для хранения капилляра в нерабочее время;

- в качестве ведущего электролита (рабочего буферного раствора) для определения лизина, треонина и цистина;

- для приготовления ведущего электролита при определении метионин

6.2.2.2 Приготовление рабочего буферного раствора для определения метионина

Навеску -циклодекстрина массой 0,114 г растворяют в пробирке в 10 см раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации (NaBO·10HO)=0,02 моль/дм (6.2.2.1). Полученную смесь закрывают пробкой и слегка нагревают на водяной бане при температуре от 50 °С до 70 °С до полного растворения -циклодекстрина. Хранят в сосуде из полиэтилена не более 14 сут при температуре не ниже 18

6.2.2.3 Подготовка буферных растворов для проведения измерений

Непосредственно перед началом измерений рабочие буферные растворы необходимо:

- профильтровать через ацетатно-целлюлозный фильтр, отбросив первые порции фильтрата (1-2 см);

- дегазировать центрифугированием. Для этого в пробирки Эппендорфа помещают 0,5 см соответствующего раствора (6.2.2.1 или 6.2.2.2), плотно закрывают пробками и центрифугируют в течение 2 мин при скорости вращения 6000 об/мин.

6.2.3 Приготовление градуировочных растворов аминокислот (АК)

6.2.3.1 Приготовление запасных растворов АК с массовыми концентрациями, г/дм:

- лизина - 2,50;

- метионина и треонина - 1,00;

- цистина - 0,50;

- аргинина - 1,00.

Для приготовления растворов лизина, метионина, треонина и аргинина необходимую навеску каждой АК (см. таблицу 2) помещают в отдельную мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой.

Таблица 2

Аминокислота	Навеска, г	Концентрация, г/дм
L-лизин моногидрохлорид*	0,3124	2,50
L-метионин	0,1000	1,00
L-треонин	0,1000	1,00
L-цистин	0,0500	0,50
L-аргинин	0,1000	1,00
________________ * В случае L-лизина дигидрохлорида величина навески 0,3747 г; L-лизина моногидрата величина навески 0,2808 г.

Для приготовления раствора цистина навеску массой 0,050 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в 10 см раствора соляной кислоты молярной концентрации (HCI)=0,1 моль/дм (6.2.1.5), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения запасных растворов АК в герметично закрытой посуде - 6 мес при температуре от 4 °С до 6 °С.

6.2.3.2 Приготовление запасного раствора бензойной кислоты массовой концентрации 1,00 г/дм

Навеску бензойной кислоты массой 0,100 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в 20 см раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации 0,05 моль/дм (6.2.1.3), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Срок хранения - 6 мес.

6.2.3.3 Приготовление рабочего раствора бензойной кислоты массовой концентрации 5 мг/дм

В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 0,5 см запасного раствора бензойной кислоты массовой концентрации 1,00 г/дм (6.2.3.2), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Срок хранения - 1 мес.

6.2.3.4 Приготовление смешанного раствора аргинина и бензойной кислоты

В мерную колбу вместимостью 25 см помещают 5 см раствора аргинина (6.2.3.1) и 0,625 см запасного раствора бензойной кислоты (6.2.3.2), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Массовые концентрации компонентов составляют: аргинина - 200 мг/дм, бензойной кислоты - 25 мг/дм.

Срок хранения - 3 мес.

6.2.3.5 Приготовление исходной градуировочной смеси N 1

В полиэтиленовом сосуде вместимостью 20 см смешивают по 2 см запасных растворов лизина, метионина, треонина и цистина (6.2.3.1) и раствора аргинина с бензойной кислотой (6.2.3.4). Массовые концентрации компонентов в растворе, мг/дм:

- лизина - 500;

- метионина - 200;

- треонина - 200;

- цистина -100;

- аргинина - 40;

- бензойной кислоты - 5.

Срок хранения смеси в герметично закрытой посуде - 1 мес в холодильнике.

6.2.3.6 Приготовление рабочей градуировочной смеси N 2

В полиэтиленовом сосуде вместимостью 10 см смешивают 1 см смеси N 1 (6.2.3.5), 0,8 см смешанного раствора (6.2.3.4) и 3,2 см дистиллированной воды. Массовые концентрации компонентов в смеси, мг/дм:

- лизина -100;

- метионина - 40;

- треонина - 40;

- цистина - 20;

- аргинина - 40;

- бензойной кислоты - 5.

Примечания