ГОСТ Р 52347-2005
Группа С19
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ
Определение содержания аминокислот (лизина, метионина, треонина, цистина и триптофана) методом капиллярного электрофореза
Mixed fodders, raw mixed fodders. Determination of amino acids (lysine, methionine, threonine, cystine and triptophane) content by method of capillary electrophoresis
ОКС 65.120
ОКСТУ 9209
Дата введения 2006-07-01
Предисловие
Задачи, основные принципы и правила проведения работ по национальной стандартизации в Российской Федерации установлены ГОСТ Р 1.0-92 "Государственная система стандартизации Российской Федерации. Основные положения" и ГОСТ Р 1.2-92 "Государственная система стандартизации Российской Федерации. Порядок разработки государственных стандартов"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (ОАО "ВНИИКП"), Научно-производственной фирмой аналитического приборостроения "Люмэкс" (НПФ АП "Люмэкс"), Федеральным государственным учреждением "Ленинградской межобластной ветеринарной лабораторией" (ФГУ ЛМВЛ)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 31 мая 2005 г. N 136-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе "Национальные стандарты", а текст этих изменений - в информационных указателях "Национальные стандарты". В случаях пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе "Национальные стандарты"
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на комбикорма и комбикормовое сырье и устанавливает экспрессный метод определения содержания аминокислот: лизина, метионина, треонина, цистина и триптофана с помощью капиллярного электрофореза.
Метод основан на разделении в кварцевом капилляре под действием электрического поля ионных форм аминокислот и на их детектировании по собственному поглощению в ультрафиолетовой (УФ) области.
Идентификацию и количественное определение анализируемых аминокислот проводят с помощью установленного программного обеспечения.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 4107-78 Бария гидроокись 8-водная. Технические условия
ГОСТ 4199-76 Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 10521-78 Кислота бензойная. Технические условия
ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 13979.0-86 Жмыхи, шроты и горчичный порошок. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 17083-87 Электротепловентиляторы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 17681-82 Мука животного происхождения. Методы испытаний
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 27262-87 Корма растительного происхождения. Метод отбора проб
ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498-98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Диапазоны измерений содержания аминокислот и метрологические характеристики метода
Диапазоны измерений содержания аминокислот (АК) и значения показателей повторяемости, воспроизводимости и точности приведены в табл.1 (при вероятности =0,95).
Таблица 1
Наименование определяемого компонента и диапазон измерений | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратичное отклонение повторяемости) , % | Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратичное отклонение воспроизводимости) , % | Показатель точности (границы относительной погрешности) , % |
Лизин, г/дм: | |||
от 0,25 до 1 ,0 включ. | 20 | 25 | 50 |
" 2,5 " | 15 | 20 | 40 |
" 2,5 " 10 " | 10 | 14 | 28 |
Метионин, г/дм: | |||
от 0,3 до 1,0 включ. | 20 | 25 | 50 |
" 3,0 " | 15 | 20 | 40 |
Треонин, г/дм: | |||
от 0,25 до 1,0 включ. | 20 | 25 | 50 |
" 3,0 " | 15 | 18 | 36 |
Цистин, г/дм: | |||
от 0,2 до 2,0 включ. | 20 | 25 | 50 |
Триптофан, г/дм: |
| ||
от 0,1 до 2,0 включ. | 11 | 15 | 30 |
4 Требования техники безопасности
4.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004, ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019.
4.2 Помещение, в котором проводится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с реактивами необходимо проводить в вытяжном шкафу.
4.3 При работе с концентрированными кислотами и щелочами необходимо использовать резиновые перчатки.
5 Отбор и подготовка проб к выполнению измерений
5.1 Отбор проб - по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 13979.0, ГОСТ 17681, ГОСТ 27262, ГОСТ 27668.
5.2 Подготовка пробы к анализу - по ГОСТ Р 51419 с использованием сита с отверстиями диаметром 1 мм.
6 Определение содержания лизина, метионина, треонина и цистина
6.1 Средства измерений, оборудование, материалы и реактивы
Система капиллярного электрофореза с диапазоном изменения рабочего напряжения от 1 до 25 кВ, системой поддержания рабочей температуры капилляра, спектрофотометрическим детектором, предназначенным для регистрации оптического поглощения в области 190-200 нм, снабженная кварцевым капилляром (эффективная длина 65 см, внутренний диаметр 0,05 мм), типа "Капель-105" по [1].
Программно-аппаратный комплекс для сбора и обработки хроматографических данных типа "МультиХром для Windows", версия не ниже 1.5.
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,001 г и ±0,02 г.
Холодильник бытовой по ГОСТ 16317 любой марки.
рН-метр лабораторный (основная погрешность измерения не более ±0,05 единиц рН).
Центрифуга лабораторная марки ШХ 2.779.040 со скоростью вращения не менее 6000 об/мин.
Шкаф сушильный лабораторный с терморегулятором, обеспечивающим поддержание температуры (110±2) °С.
Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.
Вентилятор по ГОСТ 17083.
Эксикатор по ГОСТ 25336.
Баня водяная с регулятором нагрева.
Бутыли из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой вместимостью 10, 20, 100, 500 и 1000 см.
Колбы конические со шлифом К-1-25(1000)-14/23(19/26, 24/29) по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 1(2)-25(50, 100, 1000)-2 по ГОСТ 1770.
Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-2-1(5, 10) по ГОСТ 29227.
Пипетки с одной отметкой 1(2)-2-1(5, 10, 20) по ГОСТ 29169.
Микродозаторы переменного объема 5-50 мм, 50-200 мм, 200-1000 мм и пределом допускаемой погрешности измерения не более ±5% по [2].
Пробирки П2Т-25ТС по ГОСТ 25336.
Пробирки для микропроб однократного применения (типа Эппендорфа) вместимостью 1,5 см по [3].
Стаканчики для взвешивания (бюксы) СВ-14/8 (19/9, 24/10, 34/12) по ГОСТ 25336.
Воронки В-25(36)-36(80) ХС по ГОСТ 25336.
Ампулы стеклянные с перетяжкой вместимостью 20 см из стекла по ГОСТ 21400.
Виалы стеклянные с герметично завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см для кислотного гидролиза.
Фильтры целлюлозно-ацетатные, размер пор 0,2 мкм, диаметр 25 мм.
Фильтры обеззоленные "синяя лента" по [4].
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор молярной концентрации (NaOH)=0,5 моль/дм.
L-лизин моногидрохлорид, L-метионин, L-цистин, L-треонин, L-аргинин квалификации не ниже "ч.", "Флука", Швейцария. (Допускается использовать D-, а также смесь DL-аминокислот).
Кислота соляная по ГОСТ 3118, растворы молярных концентраций (HCI)=1 моль/дм, (HCI)=0,1 моль/дм, (HCI)=6 моль/дм.
-циклодекстрин, "Флука", Швейцария.
Натрий тетраборнокислый, стандарт-титр [5].
Натрий тетраборнокислый 10-водный по ГОСТ 4199, растворы молярных концентраций (NaBO·10HO)=0,05 моль/дм и (NaBO·10HO)=0,02 моль/дм.
Кислота бензойная по ГОСТ 10521.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечания
1 Допускается применение средств измерений и оборудования с такими же или лучшими метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.
2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.
3 Требования к обработке посуды и использованию оснастки, необходимой для выполнения измерений, в соотве
тствии с приложением А.
6.2 Подготовка к проведению измерений
6.2.1 Приготовление вспомогательных растворов
6.2.1.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации (HCI)=1 моль/дм
8,3 см концентрированной соляной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Возможно использование стандарт-титра соляной кислоты. Срок хранения не ограничен.
6.2.1.2 Приготовление раствора гидроокиси натрия молярной концентрации (NaOH)=0,5 моль/дм
Навеску гидроокиси натрия массой 2,000 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в 50-60 см дистиллированной воды и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой. Раствор хранят в емкости из полиэтилена с плотно завинчивающейся крышкой не более 2 мес.
Растворы по 6.2.1.1 и 6.2.1.2 предназначены только для промывок капилляра.
6.2.1.3 Приготовление раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации (NaBO·10HO)=0,05 моль/дм.
Раствор готовят из стандарт-титра по прилагаемой к нему инструкции и хранят в полиэтиленовой посуде, закрыв пробкой. Срок хранения раствора - 2 мес.
Примечание - При отсутствии стандарт-титра раствор готовят из 10-водного тетраборнокислого натрия. Для этого навеску препарата массой 19,071 г растворяют в мерной колбе вместимостью 1 дм в свежепрокипяченной и охлажденной без доступа воздуха дистиллированной воде. рН раствора при 20 °С должен быть 9,22±0,10.
6.2.1.4 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации (HCI)=6 моль/дм
100 см концентрированной соляной кислоты смешивают с равным объемом дистиллированной воды. Срок хранения не ограничен. Раствор используют для гидролиза проб.
6.2.1.5 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации (HCI)=0,1 моль/дм
Раствор готовят из стандарт-титра по прилагаемой к нему инструкции. Срок хранения не ограничен.
6.2.2 Приготовление буферных растворов
6.2.2.1 Приготовление рабочего буферного раствора молярной концентрации тетраборнокислого натрия (NaBO·10HO)=0,02 моль/дм
20 см раствора тетраборнокислого натрия, приготовленного по 6.2.1.3, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см и доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают и используют:
- для кондиционирования капилляра;
- для хранения капилляра в нерабочее время;
- в качестве ведущего электролита (рабочего буферного раствора) для определения лизина, треонина и цистина;
- для приготовления ведущего электролита при определении метионин
6.2.2.2 Приготовление рабочего буферного раствора для определения метионина
Навеску -циклодекстрина массой 0,114 г растворяют в пробирке в 10 см раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации (NaBO·10HO)=0,02 моль/дм (6.2.2.1). Полученную смесь закрывают пробкой и слегка нагревают на водяной бане при температуре от 50 °С до 70 °С до полного растворения -циклодекстрина. Хранят в сосуде из полиэтилена не более 14 сут при температуре не ниже 18
6.2.2.3 Подготовка буферных растворов для проведения измерений
Непосредственно перед началом измерений рабочие буферные растворы необходимо:
- профильтровать через ацетатно-целлюлозный фильтр, отбросив первые порции фильтрата (1-2 см);
- дегазировать центрифугированием. Для этого в пробирки Эппендорфа помещают 0,5 см соответствующего раствора (6.2.2.1 или 6.2.2.2), плотно закрывают пробками и центрифугируют в течение 2 мин при скорости вращения 6000 об/мин.
6.2.3 Приготовление градуировочных растворов аминокислот (АК)
6.2.3.1 Приготовление запасных растворов АК с массовыми концентрациями, г/дм:
- лизина - 2,50;
- метионина и треонина - 1,00;
- цистина - 0,50;
- аргинина - 1,00.
Для приготовления растворов лизина, метионина, треонина и аргинина необходимую навеску каждой АК (см. таблицу 2) помещают в отдельную мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой.
Таблица 2
Аминокислота | Навеска, г | Концентрация, г/дм |
L-лизин моногидрохлорид* | 0,3124 | 2,50 |
L-метионин | 0,1000 | 1,00 |
L-треонин | 0,1000 | 1,00 |
L-цистин | 0,0500 | 0,50 |
L-аргинин | 0,1000 | 1,00 |
________________ |
Для приготовления раствора цистина навеску массой 0,050 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в 10 см раствора соляной кислоты молярной концентрации (HCI)=0,1 моль/дм (6.2.1.5), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.
Срок хранения запасных растворов АК в герметично закрытой посуде - 6 мес при температуре от 4 °С до 6 °С.
6.2.3.2 Приготовление запасного раствора бензойной кислоты массовой концентрации 1,00 г/дм
Навеску бензойной кислоты массой 0,100 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в 20 см раствора тетраборнокислого натрия молярной концентрации 0,05 моль/дм (6.2.1.3), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Срок хранения - 6 мес.
6.2.3.3 Приготовление рабочего раствора бензойной кислоты массовой концентрации 5 мг/дм
В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 0,5 см запасного раствора бензойной кислоты массовой концентрации 1,00 г/дм (6.2.3.2), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Срок хранения - 1 мес.
6.2.3.4 Приготовление смешанного раствора аргинина и бензойной кислоты
В мерную колбу вместимостью 25 см помещают 5 см раствора аргинина (6.2.3.1) и 0,625 см запасного раствора бензойной кислоты (6.2.3.2), доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой и перемешивают. Массовые концентрации компонентов составляют: аргинина - 200 мг/дм, бензойной кислоты - 25 мг/дм.
Срок хранения - 3 мес.
6.2.3.5 Приготовление исходной градуировочной смеси N 1
В полиэтиленовом сосуде вместимостью 20 см смешивают по 2 см запасных растворов лизина, метионина, треонина и цистина (6.2.3.1) и раствора аргинина с бензойной кислотой (6.2.3.4). Массовые концентрации компонентов в растворе, мг/дм:
- лизина - 500;
- метионина - 200;
- треонина - 200;
- цистина -100;
- аргинина - 40;
- бензойной кислоты - 5.
Срок хранения смеси в герметично закрытой посуде - 1 мес в холодильнике.
6.2.3.6 Приготовление рабочей градуировочной смеси N 2
В полиэтиленовом сосуде вместимостью 10 см смешивают 1 см смеси N 1 (6.2.3.5), 0,8 см смешанного раствора (6.2.3.4) и 3,2 см дистиллированной воды. Массовые концентрации компонентов в смеси, мг/дм:
- лизина -100;
- метионина - 40;
- треонина - 40;
- цистина - 20;
- аргинина - 40;
- бензойной кислоты - 5.
Примечания