ГОСТ Р 52174-2003
Группа Н11
Н13
Н17
Н23
Н27
Н31-Н34
Н36
Н41-Н43
Н51-Н56
Н62
Н65
Н68
Н72-Н74
Н81
Н97
С11-13
С21
С23-С25
С32-С36
С41-С45
С52
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Биологическая безопасность
СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ
Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ)
растительного происхождения с применением биологического микрочипа
Biological safety. Raw and food-stuffs. Method for the identification of genetically modified organisms (GMO) of plant origin by using biological microchip
ОКС 65.140
65.160
67.060
67.080
67.100
67.120
67.140
67.140.30
67.160
67.180
67.190
67.200
67.220
67.230
ОКСТУ 9109
9209
9709
Дата введения 2004-07-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Институтом физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН и Институтом молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН
ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 447 "Биологическая безопасность пищевых продуктов, кормов и товаров народного потребления и методы ее контроля"
2 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 2003 г. N 403-ст
3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
ВНЕСЕНА поправка, опубликованная в ИУС N 9, 2005 год
Поправка внесена изготовителем базы данных
ВНЕСЕНО Изменение N 2, утвержденное и введенное в действие Приказом Росстандарта от 22.11.2013 N 1896-ст c 01.07.2014
Изменение N 2 внесено изготовителем базы данных по тексту ИУС N 4, 2014
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевое сырье (в том числе посевной и посадочный материал), пищевые продукты, цветы (далее - продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с использованием биологического микрочипа.
Метод основан на асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее - амПЦР) с последующей гибридизацией продуктов этой амПЦР на биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее десяти различных трансгенных последовательностей ДНК. Чувствительность метода - не менее 10
г (1 нг, ~10
геном-эквивалентов тотальной растительной ДНК/1 мкл пробы).
(Измененная редакция, Изм. N 2).
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия
ГОСТ 13646-68 Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия
ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия
ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
(Измененная редакция, Изм. N 2).
3 Определения
В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 биологическая безопасность: В соответствии с приложением А.
3.2 генетически модифицированные источники: Сырье и пищевые продукты (компоненты), используемые человеком в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов или содержащие их в своем составе.
3.3 генетически модифицированный организм: Организм, генетический материал которого изменен с применением методов генной инженерии.
3.4 генная инженерия: Совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных нуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.
3.5 биологический микрочип: Микроматрица с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов.
3.6 праймер: Последовательность однотяжевой ДНК длиной до 25 нуклеотидов, применяемая для проведения асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции.
3.7 асимметричная мультиплексная полимеразная цепная реакция: Полимеразная цепная реакция, где в одной пробирке с участием нескольких пар праймеров одновременно амплифицируются разные последовательности анализируемой ДНК, причем количество одного из праймеров каждой пары в несколько раз превышает количество другого праймера.
4 Аппаратура, материалы и реактивы
4.1 Универсальный аппаратно-программный комплекс (УАПК) для анализа биологических микрочипов с компьютерной программой для анализа полученных результатов [1].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.2 Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.3 Амплификатор ДНК типа "Терцик" под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2, 0,5 см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с [2].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.4 Термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой 37 °С, рабочий диапазон от 20 °С до 60 °С, точность поддержания температуры ±1 °С [3].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.5 Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 высокого класса точности (условное обозначение 
) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,0001 г.
4.6 Камера морозильная по ГОСТ 26678, обеспечивающая температуру минус 20 °С.
4.7 Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.
4.8 Микроцентрифуга настольная типа 5415С с частотой вращения не менее 13000 мин
[4].
(Измененная редакция, Изм. N 3).
4.9 Мешалка магнитная с подогревом [5].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.10 Аппарат для встряхивания типа CV-1500 с частотой вращения не менее 1500 мин [6].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.11 рН-метр с набором электродов, с погрешностью измерений ±0,1 рН.
4.12 Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5-10,0 мм (шаг - 0,1 мм, точность ±2,5%-10,0%, воспроизводимость 3%-7%); 5,0-50,0 мм (шаг - 0,5 мм, точность ±2,0%-5,0% , воспроизводимость 2,5%-5%); 20,0-200,0 мм (шаг - 1,0 мм, точность ±1,5%-2,0%, воспроизводимость 2%-3%); 100-1000 мм (шаг - 5 мм, точность ±1,0%-1,5%, воспроизводимость 1%-2%).
4.13 Штативы под микроцентрифужные пробирки типа RP-30 и RP-80 на 30 и 80 шт. [7].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.14 Наконечники с фильтром для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей до 10; 20; 200; 1000 мм [8].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.15 Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 см стерильные.
4.16 Пестик или палочка стеклянные по ГОСТ 21400 для микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см.
4.17 Цилиндры стеклянные мерные лабораторные по ГОСТ 1770 на 25, 100, 250 и 1000 см.
4.18 Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические по ГОСТ 25336 вместимостью 50-1000 см.
4.19 Пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227.
4.20 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
4.21 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328.
4.22 Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 3118, х.ч.
4.23 Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.
4.24 Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрат (ЭДТА) [9].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.25 Трис(оксиметил)аминометан [10].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.26 Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.
4.27 Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805, х.ч.
4.28 Цетилтриметиламмоний бромид [11].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.29 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
4.30 Вода особо чистая стерильная, не содержащая ДНК, РНК и дезоксирибонуклеаз.
4.31 Фермент термостабильный HotTaq-полимераза для ПЦР с "горячим стартом", оптимум активности при температуре 70 °С - 72 °С [12].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.32 ПЦР буфер десятикратный (10х; 12,1 г в 1 дм Трис-HCl, рН 8,8; 37,28 г в 1 дм КСl, 5% Твин-20, 50% формамид; 142,83 мг в 1 дм MgCl
).
4.33 Буфер гибридизационный [13].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.34 Баня водяная [18].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.35 Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дУТФ, дЦТФ с молярной концентрацией по 2 мМ каждого [14].
(Измененная редакция, Изм. N 2.
4.36 Раствор флуоресцентного субстрата ФС [15].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.37 Раствор заведомо трансгенной ДНК (около 100 нг/мм или 10
копий/мм) [16].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.38 Раствор заведомо нетрансгенной ДНК (около 100 нг/мм или 10 копий/мм) [17].
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.39 Раствор водный праймеров "ПР-1" для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [19]:
- праймеры для амплификации фрагмента гена RBCL, кодирующего большую субъединицу рибулозы-1,5-бифосфат карбоксилазы/оксигеназы (Асc. N Z95552, поз.160-720);
- праймеры для амплификации фрагмента гена лектина LE1 (Асc. N К00821М30884, поз.1080-1720);
- праймеры для амплификации фрагмента гена IVR1, кодирующего бета-фруктозидазу (Асc. N U16123, поз.300-1090);
- праймеры для амплификации фрагмента 35S-промотора вируса мозаики цветной капусты (Асc. N FM 177585, поз.3560-3870);
- праймеры для амплификации фрагмента 35S-терминатора вируса мозаики цветной капусты (Асc. N FM177585, поз.1260-1590);
- праймеры для амплификации фрагмента 35S-промотора каулимовируса мозаики норичника (FMV, Асc. N Х06166, поз.6260-6630);
- праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена белка теплового шока пшеницы (Асc. N Х58279,поз.10-210);
- праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена BAR, определяющего устойчивость к фосфинотрицину (Асc. N AY310901, поз.380-920);
- праймеры для амплификации фрагмента терминатора nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens: (Асc. N FM177585, поз.10-370).
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.40 Раствор водный праймеров "ПР-2" для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров [20]:
- праймеры для амплификации фрагмента гена фосфорилазы УДФ-глюкозы (UDP-GP) (Асc. N D00667, поз.50-310);
- праймеры для амплификации фрагмента гена фосфат-синтазы риса (SPS) (Асc. N U33175, поз.5910-6250);
- праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена nptll из транспозона Тn5 бактериального происхождения (Асc. N EU886197, поз.9792-10145);
- праймеры для амплификации фрагмента терминатора ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens (Асc. N AJ311872, поз.5050-5240);
- праймеры для амплификации фрагмента терминатора гена RBCS гороха (Асc. N FM177582.1, поз.5782-5920);
- праймеры для амплификации фрагмента промотора гена актина риса АСТ1 (Асc. N S44221, поз.12-380);
- праймеры для амплификации фрагмента маркерного гена gus из бактерии Escherichia coli (Асc. N EU503042, поз.2770-3140).
(Измененная редакция, Изм. N 2).
4.41 Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами, назначение которых приведено в таблице 1 (название олигонуклеотида соответствует изображенному на рисунке 1) [21]:
Таблица 1 - Обозначение и назначение олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных на биологическом микрочипе
Наименование олигонуклеотида | Детектируемая мишень | Назначение олигонуклеотида | |
pIDNA (rbcL) | ген RBCL | Зонд для идентификации ДНК растительного происхождения в анализируемом материале | |
GM/ST1(RBCL) | ген RBCL | Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК сои и/или картофеля | |
ZM1(RBCL) | ген RBCL | Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК кукурузы | |
OS1 (RBCL) | ген RBCL | Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК риса | |
ST1 | ген RBCL | Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК картофеля | |
GM2(RBCL) | ген RBCL | Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК сои | |
ZM/OS2(RBCL) | ген RBCL | Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК кукурузы и/или риса | |
ST2(RBCL) | ген RBCL | Видоспецифичный зонд для идентификации ДНК картофеля | |
Le1(Gm) | ген лектина (LE1) | Специфичный зонд для идентификации ДНК сои | |
Zein(Zm) | ген IVR1 | Специфичный зонд для идентификации ДНК кукурузы | |
UDP-GP (St) | ген фосфорилазы УДФ-глюкозы | Специфичный зонд для идентификации ДНК картофеля | |
SPS (Os) | ген фосфат-синтазы риса | Специфичный зонд для идентификации ДНК риса | |
nptll | ген npt | Специфичный зонд для идентификации маркерного гена nptll из транспозона Тn5 | |
35S_p CAMV | промотор 35S | Специфичный зонд для идентификации 35S промотора вируса мозаики цветной капусты | |
35S_p FMV | промотор FMV | Специфичный зонд для идентификации 35S FMV промотора каулимовируса мозаики норичника | |
Act1_p | ген актина АСТ1 | Специфичный зонд для идентификации промотора гена актина риса | |
Gus | ген gus | Специфичный зонд для идентификации маркерного гена gus | |
nos_t | терминатор nos | Специфичный зонд для идентификации терминатора nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens | |
35S_t CAMV | терминатор 35S | Специфичный зонд для идентификации 35S терминатора вируса мозаики цветной капусты | |
rbcSt | Терминатор гена RBCS | Специфичный зонд для идентификации терминатора гена RBCS гороха | |
Ocs_t | Терминатор Ocs | Специфичный зонд для идентификации терминатора ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens | |
Bar | ген BAR | Специфичный зонд для идентификации маркерного гена BAR | |
Рисунок 1 - Схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения
Рисунок 1 - Схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения
Обозначение ячеек приведено в соответствии с назначением иммобилизованного в ней зонда, указанного в таблице 1.
Биологический микрочип представляет собой пластиковую подложку, выполненную в формате предметного стекла по ГОСТ 9284, на поверхности которой в определенном порядке расположена 31 ячейка полиакриламидного геля в форме полусферы диаметром 100 мкм (обозначены кружками на рисунке 1). 22 из них содержат индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (перечень и назначение олигонуклеотидов приведены в таблице 1). Пять ячеек с индексом "0" не содержат перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Четыре ячейки с индексом "М", содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для автоматического вычисления интенсивности флуоресценции ячеек биологического микрочипа после гибридизации. Поверхность биологического микрочипа должна быть закрыта специальной составной крышкой с отверстиями, которая вместе с подложкой образует гибридизационную камеру, предназначенную для проведения реакции гибридизации анализируемых ПЦР-продуктов с иммобилизованными на биологическом микрочипе олигонуклеотидами, и исключающую возможность испарения реакционной смеси в процессе гибридизации. Диагностическая специфичность при идентификации растительной ДНК сои, картофеля, кукурузы, риса составляет не менее 95%.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
5 Отбор проб
Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья (в том числе посевного и посадочного материала), пищевых продуктов, цветов.
6 Подготовка к проведению анализа
6.1 Приготовление растворов
6.1.1 Приготовление раствора NaOH концентрации 40 г/дм
В стеклянную плоскодонную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 см помещают 4,0 г сухой гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 и растворяют в 100 см особо чистой стерильной воды по 4.30. После охлаждения раствора до комнатной температуры его переливают в специальную щелочеустойчивую пластиковую плотно закрывающуюся емкость. Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года.
6.1.2 Приготовление раствора ЭДТА концентрации 74,4 г/дм
В стеклянную плоскодонную колбу вместимостью 100 см помещают 7,44 г ЭДТА по 4.24, растворяют в 80 см особо чистой стерильной воды при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке [6]. Затем раствором 
по 6.1.1 доводят рН раствора до 8,0. Полученный раствор переливают в мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 см и особо чистой стерильной водой доводят объем этого раствора до метки. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре 4 °С - 5 °С - не более 6 мес.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.1.3 Приготовление 70%-ного раствора этилового спирта
В мерную колбу вместимостью 200 см по ГОСТ 12738 вносят 140 см 96%-ного этилового спирта высокой степени очистки по ГОСТ Р 51652, добавляют 52 см особо чистой стерильной воды и перемешивают. Срок хранения при температуре 4 °С-5 °С - не более 6 мес.
6.1.4 Приготовление раствора Трис-
массовой концентрации 242,2 г/дм
В колбу вместимостью 100 см помещают 24,22 г трис(оксиметил)аминометана по 4.25 [10] и растворяют приблизительно в 80 см особо чистой стерильной воды. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят рН раствора до 7,5 ед. рН, а объем - до 100 см особо чистой стерильной водой.
Срок хранения при комнатной температуре - не более 6 мес.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.1.5 Приготовление раствора 
массовой концентрации 146,2 г/дм
В плоскодонную колбу вместимостью 100 см помещают 14,62 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в 70-80 см особо чистой стерильной воды, затем полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки.
Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.1.6 Приготовление ЦТАБ-буфера
В стеклянную колбу вместимостью 100 см помещают 2,0 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11], далее добавляют 5 см раствора Трис-HCI, приготовленного по 6.1.4, 56 см раствора NaCI, приготовленного по 6.1.5, и 10 см раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.2. Объем раствора доводят до 100 см особо чистой стерильной водой. Перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения соли.
Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.1.7 Приготовление ЦТАБ-раствора
В стеклянную колбу вместимостью 100 см помещают 0,5 г сухого цетилтриметиламмония бромида по 4.28 [11], и добавляют 1,6 см раствора , приготовленного по 6.1.5. Объем раствора доводят до 100 см особо чистой стерильной водой.
Срок хранения при температуре 4 °С - 5 °С - не более месяца, в морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 °С - до одного года.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.1.8 Приготовление разведенного раствора
В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 48 см раствора , приготовленного по 6.1.5, и особо чистой стерильной водой доводят объем раствора до метки.
Срок хранения при комнатной температуре - не более 6 мес.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.1.9 Раствор Taq-полимеразы по 4.31 хранят при температуре минус 20 °С не более шести месяцев. Не допускается хранение раствора Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 °С".
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.2 Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)
6.2.1 Две параллельные пробы анализируемого продукта массой около 100 мг каждая помещают в две чистые стерильные микроцентрифужные пробирки по 4.15 вместимостью 1,5 см, добавляют по 500 мм ЦТАБ-буфера, приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания по 4.10 [6] в течение 2 мин и выдерживают 15-20 мин при температуре 65 °С в термостате для микропробирок.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.2.2 Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.1, центрифугируют при комнатной температуре в настольной центрифуге по 4.8 [4] при частоте вращения 13000 мин в течение 10 мин.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.2.3 Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.2, отбирают микродозатором (обычно по 500 мм) и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем хлороформа по ГОСТ 20015. Содержимое перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 2 мин и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13000 мин.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.2.4 Верхнюю жидкую фазу из смеси, полученной по 6.2.3, аккуратно отбирают микродозатором в чистые микроцентрифужные пробирки, не захватывая промежуточную или нижнюю фазу. В пробирки добавляют два объема ЦТАБ-раствора, приготовленного по 6.1.7, аккуратно перемешивают, переворачивая пробирки вручную, и выдерживают 60 мин при комнатной температуре.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.2.5 Смесь, полученную по 6.2.4, центрифугируют 5 мин при частоте вращения 13000 мин. Надосадочную жидкость тщательно удаляют микродозатором, а осадок растворяют в 350-600 мм (в зависимости от объема осадка) разведенного раствора , приготовленного по 6.1.8, добавляют равный объем хлороформа по ГОСТ 20015, перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 30 сек и центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13000 мин.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.2.6 Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.5, отбирают микродозатором и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, добавляют равный объем изопропилового спирта по 4.27, аккуратно перемешивают содержимое пробирок вручную и выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.2.7 Смесь, полученную по 6.2.6, центрифугируют 10 мин при частоте вращения 13000 мин, надосадочную жидкость аккуратно сливают, а к осадку ДНК добавляют 1 см 70%-ного этилового спирта, приготовленного по 6.1.3 и охлажденного до температуры 0 °С - 4 °С, перемешивают и центрифугируют 5 мин при частоте вращения 13000 мин.
6.2.8 Полученную надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК подсушивают при комнатной температуре до полного удаления этилового спирта, но не более 30 мин.
6.2.9 Осадок ДНК, полученный по 6.2.8, перерастворяют в 40-50 мм особо чистой стерильной воды. Полученный раствор ДНК используют для проведения амПЦР.
Срок хранения раствора ДНК при температуре минус 20 °С - до одного года.
6.2.7-6.2.9 (Введены дополнительно. Изм. N 2).
6.3 Подготовка асимметричной мультиплексной ПЦР
6.3.1 Приготовление реакционной смеси для амПЦР*
_______________
* Реакционную смесь для амПЦР готовят непосредственно перед анализом при температуре не выше 20 °С.
6.3.1.1 Готовят две микроцентрифужные пробирки вместимостью по 1,5 см и маркируют их "М1" и "М2".
В пробирку "М1" микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2,5 мм 10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2,5 мм смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.35 [14], 2 мм фермента Taq-полимеразы по 4.31 [12] (концентрацией 5 Ед. акт/мм)*, 1 мм флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 [15], а также 1 мм водного раствора праймеров "ПР-1" по 4.40 [19].
_______________
* Срок хранения Taq-полимеразы после разведения при температуре от 2 °С до 8 °С - не более 2 ч.
В пробирку "М2" микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 2,5 мм 10х буфера реакционного для ПЦР по 4.32; 2,5 мм смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по 4.35 [14], 2 мм фермента Taq-полимеразы по 4.31 [12] (концентрацией 5 Ед. акт/мм)*, 1 мм флуоресцентного субстрата ФС по 4.36 [15], а также 1 мм водного раствора праймеров "ПР-2" по 4.41 [20].
_______________
* Срок хранения Taq-полимеразы после разведения при температуре от 2 °С до 8 °С - не более 2 ч.
Смесь разбавляют особо чистой стерильной водой до объема 20 мм (из расчета на одну анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3-5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены. Общий объем реакционных смесей в микропробирках "М1" и "М2" для амПЦР готовят с учетом числа анализируемых проб и двух контрольных проб: положительный контроль (заведомо трансгенная ДНК по 4.37) и отрицательный контроль (заведомо нетрансгенная ДНК по 4.38).
(Измененная редакция, Изм. N 2).
6.3.1.2 Реакционную смесь для амПЦР, полученную по 6.3.1.1, осаждают кратковременным (10-15 с) центрифугированием на настольной центрифуге при частоте вращения 1500-3000 мин и сразу же используют для проведения анализа.
6.3.2 Все этапы амПЦР должен проводить квалифицированный, специально обученный персонал в соответствии с требованиями [22]. Для проведения амПЦР допускается использовать только стерильную лабораторную посуду и новые стерильные микроцентрифужные пробирки. При проведении амПЦР каждую микроцентрифужную пробирку открывают только перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром.
7 Проведение анализа
7.1 Проведение асимметричной мультиплексной ПЦР
7.1.1 Для каждой анализируемой пробы готовят 2 чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2 или 0,5 см, маркируя их "N
" и "N", где N - номер анализируемой пробы.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
7.1.2 Реакционные смеси для амПЦР "М1" и "М2", полученные по 6.3.1.1-6.3.1.2, микродозатором вносят в микроцентрифужные пробирки по 20 мм в каждую таким образом, чтобы смесь "М1" была распределена по пробиркам с индексом "N", а смесь "М2" - по пробиркам с индексом "N.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
7.1.3 Анализируемую ДНК пробы N, выделенную по 6.2, вносят микродозатором по 5 мм в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для амПЦР по 7.1.2, маркированные, соответственно, "N" и "N". При использовании амплификатора ДНК [2] без подогрева крышки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносят по 30 мм вазелинового масла по ГОСТ 3164 для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при амПЦР. В этом случае анализируемую ДНК вносят под слой масла, в результате чего образуются водная и масляная фазы.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
7.1.4 В две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль).
(Измененная редакция, Изм. N 2).
7.1.5 Затем еще в две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 5 мм раствора заведомо нетрансгенной ДНК (отрицательный контроль).
7.1.6 Все микроцентрифужные пробирки со смесями, подготовленными по 7.1.3-7.1.5, помещают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в таблице 2.
Таблица 2 - Программа проведения амПЦР
Шаг программы | Температура, °С | Время инкубации | Число циклов |
1 | 95 | 12 мин | 1 |
2 | 95 | 30 с | 55 |
51 | 30 с | ||
72 | 30 с | ||
3 | 72 | 10 мин | 1 |
7.1.5, 7.1.6 (Введены дополнительно. Изм. N 2)
7.2 Гибридизация на биологическом микрочипе
7.2.1 Для проведения этапа гибридизации готовят N+2 микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,5 или 1,5 см (N - количество анализируемых проб, две другие пробирки нужны для анализа положительного и отрицательного контроля).
7.2.2 В необходимое количество микроцентрифужных пробирок микродозатором вносят по 18 мм гибридизационного буфера 4.33 [13]. К гибридизационному буферу в пробирку "N" добавляют по 9 мм водной фазы ПЦР-смесей из пробирок "N" и "N", полученных в результате проведения амПЦР по 7.1.6 и перемешивают в течение 20-30 с на аппарате для встряхивания по 4.10 с частотой вращения не менее 1500 мин для получения гибридизационной смеси.
7.2.3 Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 34 мм гибридизационной смеси (для каждого биологического микрочипа), полученной по 7.2.2. Смесь вносят через любое из двух отверстий гибридизационной камеры, после чего оба отверстия закрывают крышкой. Гибридизацию проводят в термостате по 4.4 [3] при температуре 37 °С. Минимальное время гибридизации составляет 3 ч. Допускается гибридизация в течение ночи, но не более 16-18 ч.
7.2.4 После окончания гибридизации крышку реакционной камеры открывают и микродозатором отбирают гибридизационную смесь из камеры микрочипа. В любое из двух отверстий камеры вносят 34 мм дистиллированной воды по ГОСТ 6709, предварительно прогретой до температуры 37 °С. Воду выдерживают в реакционной камере биологического микрочипа в течение 1 минуты, затем отбирают. Процедуру повторяют, после чего составную крышку отсоединяют от подложки. Подложку последовательно промывают дистиллированной водой по ГОСТ 6709, этиловым спиртом по 4.26, дистиллированной водой по ГОСТ 6709 и высушивают при комнатной температуре.
Схема метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения приведена в приложении Б.
Подраздел 7 (Измененная редакция, Изм. N 2).
8 Обработка и интепретация результатов анализа
8.1 Результаты гибридизации регистрируют с помощью универсального аппаратно-программного комплекса для анализа биочипов (УАПК) [1]. Инсталляция и эксплуатация комплекса осуществляется в соответствии с руководством по эксплуатации УАПК.
8.2 Производят запуск программного обеспечения, поставляемого вместе с комплексом (файл imageware.exe). При запуске на мониторе появляется схема биочипа с указанием отдельных ячеек и обозначением находящихся в них зондов. Названия зондов соответствуют указанным в таблице 1 и на рисунке 1.
8.3 Биологический микрочип после проведения гибридизации, промывки, удаления гибридизационной камеры, ополаскивания и высушивания помещают в держатель УАПК "лицевой" стороной (содержащей гелевые ячейки) вверх.
8.4 Нажимают пиктограмму с надписью "Пуск" в верхней части диалогового окна "Снимок". При этом происходит возбуждение флуоресценции ячеек биочипа лазерами с длиной волны 640 нм, захват флуоресцентного изображения, его обработка и выдача отчета о присутствии в исследуемом образце ДНК растительного происхождения, идентификации видоспецифичной ДНК (соя, кукуруза, картофель, рис) и наличии/отсутствии генетических элементов, используемых как детерминанты трансгенности. Применение универсального аппаратно-программного комплекса (УАПК) для анализа биологических микрочипов [1] позволяет автоматизировать все этапы регистрации и интерпретации результатов и получать заключение о наличии/отсутствии ДНК растительного происхождения в исследуемом образце, а также о наличии/отсутствии генетических детерминант трансгенности.
8.5 Анализ биологических микрочипов с прогибридизованными ПЦР-продуктами, полученными при амплификации ДНК, выделенной из различных образцов, начинают с регистрации и интерпретации гибридизационных картин положительного (заведомо трансгенной ДНК) и отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК).
8.6 Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биочипе, представлен в приложении В.
8.7 В случае, если при использовании заведомо нетрансгенной ДНК регистрируют сигнал в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям фрагментов векторных конструкций и маркерных генов, это свидетельствует о получении ложноположительного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной может быть загрязнение (контаминация) ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты по ГОСТ 3118 (0,1 моль/дм), заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. В случае отсутствия сигналов в ячейках, содержащих зонды, специфичные к различным генетическим детерминантам трансгенности, при использовании заведомо нетрансгенной ДНК, делают заключение об отсутствии контаминации и проводят анализ образцов ДНК согласно протоколу.
8.8 Отсутствие флуоресцентных сигналов в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к гену RBCL, при использовании нетрансгенной растительной ДНК свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. При этом результаты анализа остальных исследуемых образцов не учитываются. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР или несоблюдение условий проведения амПЦР и/или гибридизации на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. Наличие сигнала в ячейках, содержащих олигонуклеотиды, специфичные к ДНК растительного происхождения, при использовании заведомо нетрансгенной ДНК, свидетельствует об эффективно проведенной амПЦР и гибридизации на биочипе. При этом анализ образцов ДНК проводят далее согласно протоколу.
Раздел 8 (Измененная редакция, Изм. N 2).
9 Требования безопасности
9.1 При выполнении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007.
9.2 Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.
9.3 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное). Определение термина
ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)
биологическая безопасность: Защищенность человека, общества и окружающей среды от негативного воздействия токсических, аллергенных, канцерогенных, мутагенных биологических веществ и соединений, содержащихся в природных или генно-инженерно-модифицированных биологических объектах и полученных из них продуктах.
Схема метода идентификации генетически модифицированных источников растительного происхождения с использованием биологического микрочипа
ПРИЛОЖЕНИЕ Б
(справочное)
Рисунок Б.1
А - мультиплексная асимметричная амплификация ДНК образца "N" в двух независимых пробирках "N" и "N" с уникальным набором праймеров для получения преимущественно одноцепочечных флуоресцентно меченных фрагментов;
Б - гибридизация ПЦР-продуктов, полученных в независимых пробирках "N" и "N" со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологическом микрочипе;
В - регистрация и интерпретация флуоресцентной картины гибридизации на биологическом микрочипе.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
ПРИЛОЖЕНИЕ В (обязательное). Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биологическом микрочипе (флуоресцентная картина гибридизации, полученная в результате анализа ДНК генетически модифицированной сои
ПРИЛОЖЕНИЕ В
(обязательное)
Результат анализа ДНК сои, содержащей трансгенные элементы, с использованием гибридизации на биологическом микрочипе
(флуоресцентная картина гибридизации, полученная в результате анализа ДНК генетически модифицированной сои и распределение нормированных сигналов ячеек биологического микрочипа)
Рисунок В.1
А - схема биологического микрочипа для идентификации генетически модифицированного источника растительного происхождения;
Б - гибридизационная картина на биологическом микрочипе флуоресцентных продуктов амПЦР анализируемой ДНК сои, содержащей 35S-промотор, терминатор nos. Стрелками обозначены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы.
В - распределение нормированных сигналов ячеек биологического микрочипа. Жирным шрифтом выделены ячейки, в которых образовались совершенные гибридизационные дуплексы.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
ПРИЛОЖЕНИЕ Г (рекомендуемое). Пример оформления протокола испытания
ПРИЛОЖЕНИЕ Г
(рекомендуемое)
Наименование организации (испытательная лаборатория) | |||||||||||
ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ | |||||||||||
N________от "____"______________201__г. | |||||||||||
Продукция: | Котлеты "Московские" | ||||||||||
Производитель сырья или продукции: | ООО "Вымпел" | ||||||||||
Предъявитель сырья или продукции: | Орган сертификации "Биотест-М" | ||||||||||
Отбор проб произведен | по ГОСТ 11856-89 | ||||||||||
в соответствии с нормативным документом на соответствующую однородную группу сырья или продукции | |||||||||||
Акт отбора проб и техническое задание на испытания N | 118 | от 08.02.2013 | |||||||||
Испытания проведены на основании требований ГОСТ Р 52174-2003 | |||||||||||
Номер образца: | 6/кс, 7/кс, 8/кс и 9/кс | ||||||||||
Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и состояние упаковки, этикетки, штриховка): | |||||||||||
Маркировка на упаковке, информирующая о наличии в продукте ГМИ в образцах N 6/кс, 7/кс и 8/кс | |||||||||||
отсутствует, а в образце N 9/кс присутствует. | |||||||||||
Маркировка: | - | ||||||||||
Годен до: | - | Штриховой код: | - | ||||||||
Результаты испытаний | |||||||||||
Таблица 1 - Нетрансгенные видоспецифичные последовательности
Последовательности | Номер образца | ||||
6/кс | 7/кс | 8/кс | 9/кс | При наличии | |
ген RBCL | + | + | + | + | |
GM/ST1(RBCL) | + | + | + | + | |
ZM1(RBCL) | - | - | - | - | |
OS1 (RBCL) | - | - | - | - | |
ST1 | + | + | - | - | |
GM2(RBCL) | - | - | + | + | |
ZM/OS2(RBCL) | - | - | - | - | |
ST2(RBCL) | + | + | - | - | |
Le1(Gm) | - | - | + | + | |
Zein(Zm) | - | - | - | - | |
UDP-GP (St) | + | + | - | - | |
SPS (Os) | - | - | - | - | |
Результат анализа: | В образцах 7/кс и 9/кс обнаружены следующие растительные компоненты: в | |
образце 6/кс и 7/кс обнаружено присутствие ДНК сои, а в образцах 8/кс и 9/кс обнаружено присутствие | ||
ДНК картофеля. | ||
Таблица 2 - Трансгенные видоспецифичные последовательности
Поcледовательности | Номер образца | ||||
6/кс | 7/кс | 8/кс | 9/кс | При наличии | |
nptll | - | + | - | - | |
35S_p CAMV | - | + | - | + | |
35S_p FMV | - | - | - | - | |
Act1_p | - | - | - | - | |
Gus | - | - | - | - | |
nos _t | - | - | - | + | |
35S_t CAMV | - | - | - | - | |
rbcSt | - | - | - | - | |
Ocs_t | - | - | - | - | |
Bar | - | - | - | - | |
Результат анализа: | В образцах 7/кс и 9/кс обнаружены следующие трансгенные компоненты: | |||||
в образце 7/кс обнаружен гомолог гена nptll; промотор 35S CaMV и терминатор nos, а в образце 9/кс | ||||||
обнаружены промотор 35S CaMV и терминатор nos. В образцах 6/кс и 8/кс трансгенные компоненты не | ||||||
обнаружены. Маркировка на упаковке, информирующая о наличии в продукте ГМИ, в образце 7/кс | ||||||
отсутствует, а в образце 9/кс присутствует. | ||||||
Вывод: | Все образцы содержат растительную ДНК, образец 6/кс содержит нетрансгенную ДНК сои; образец 7/кс содержит трансгенную ДНК сои; образец 8/кс содержит нетрансгенную ДНК картофеля; образец 9/кс содержит трансгенную ДНК картофеля. | |||||
Исполнители: | ||||||
Иванов И.И. | ||||||
подпись | Фамилия, инициалы | |||||
Петров П.П. | ||||||
подпись | Фамилия, инициалы | |||||
Руководитель испытательной лаборатории | ||||||
подпись | ||||||
МП | ||||||
Фамилия, инициалы | ||||||
Заключение распространяется на образец, представленный на испытания.
(Измененная редакция, Изм. N 2).
ПРИЛОЖЕНИЕ Д (справочное). Библиография
ПРИЛОЖЕНИЕ Д
(справочное)
[1] ТУ 9443-004-02699501-2006* ООО "Биочип-ИМБ" | Универсальный аппаратно-программный комплекс для анализа биологических микрочипов (УАПК) |
________________ | |
[2] ТУ 9642-001-4648062-98 | Амплификатор "Терцик МС-2" |
[3] ТУ 42-619-61 | Термостат суховоздушный ТВР-25 |
[4] Корпорация "Эппендорф", кат. N 5425000.014 | Микроцентрифуга настольная 5415С, 13000 мин |
[5] Корпорация "Хеликон", кат. N MSH-300 | Мешалка магнитная с подогревом |
[6] Корпорация "Хеликон", кат. N CV-1500 | Аппарат для встряхивания (центрифуга - вортекс) |
[7] Корпорация "Хеликон", кат. N RP-30 и RP-80 | Штативы под микроцентрифужные пробирки |
[8] Корпорация "Хеликон", кат. N FA104; FA108; FA111; FA113N | Наконечники с фильтром для микропипеток |
[9] ТУ 6-09-11-1721-83 | Этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевая соль дигидрат |
[10] ТУ 6-09-4292-76 | Трис(оксиметил)аминометан |
[11] Корпорация "Хеликон", кат. N Аm-0833 | Цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) |
[12] Корпорация "Силекс", кат. N Е0320 | Фермент HotTaq-полимераза 5 Ед. акт. в мм |
[13] ТУ 9398-003-02699501-2006 | Буфер гибридизационный |
[14] Корпорация "Силекс", кат. N N1101 | Раствор смеси дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, по 25 мМ каждого |
[15] Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБ РАН) | Флуоресцентный субстрат "ФС" |
[16] Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им.К.А.Тимирязева Российской Академии наук (ИФР РАН) | Раствор заведомо трансгенной ДНК около 100 нг/мм |
[17] Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им.К.А.Тимирязева Российской Академии наук (ИФР РАН) | Раствор заведомо нетрансгенной ДНК около 100 нг/мм |
[18] ТУ 46-22-603-75 | Баня водяная с электрическим или огневым подогревом |
[19] Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБ РАН) | Раствор водный праймеров "ПР-1" |
[20] Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБ РАН) | Раствор водный праймеров "ПР-2" |
[21] Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Российской Академии наук (ИМБ РАН) | Биологические микрочипы (биочипы) гелевые с иммобилизованными олигонуклеотидами |
[22] Государственный Комитет Санэпиднадзора Российской Федерации; N 06-19/52-17 от 15.06.95 | Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения* |
________________ | |
[23] ЗАО "НПФ ДНК-Технология" | Компьютерная программа "Gene" для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора "Джин" |
[24] ТУ 9443-005-46482062-2003 | ПЦР-детектор "Джин" |
[25] ООО "БИОМАСТЕР-ПРОМ" | Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации ДНК "CKAH-35S", "CKAH-gus", "CKAH-nos" и "СКАН-npt". |
(Измененная редакция, Изм. N 2).