ГОСТ Р 52173-2003
Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения

ГОСТ Р 52173-2003
Группа Н11
Н13
Н17
Н23
Н27
Н31-Н36
Н41-Н43
Н48
Н51-Н56
Н65
Н68
Н72
Н74
Н81
Н97
С11-С13
С21
С23-С25
С32-С36
С41-С45
С52

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ


СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения

Raw material and food-stuffs. Method for the identification of genetically modified organisms (GMO) of plant origin

ОКС 65.140
65.160

67.060
67.080

67.100
67.120

67.140
67.140.30
67.160.20
67.180.20
67.200.20
67.220

67.230
ОКСТУ 9109
9209
9709

Дата введения 2005-01-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН Государственным учреждением Научно-исследовательским институтом питания РАМН (ГУ НИИ питания РАМН), Центром "Биоинженерия" РАН

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"

2 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 29 декабря 2003 г. N 402-ст

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Июль 2010 г.

1 Область применения

     1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые сырье и продукты (далее - продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения.

Метод основан на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующими праймерами.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание

ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ 3164-78 Масло вазелиновое медицинское. Технические условия

ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 12738-77 Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия

ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Тезнические требования. Методы испытаний

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования*
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 53228-2008.


ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

3 Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 генетически модифицированные источники пищи: Продукты (компоненты), используемые человеком в пищу в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов.

3.2 генетически модифицированный организм: Организм или несколько организмов, любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии или содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинацию генов.

3.3 генная инженерия: Совокупность приемов, методов и технологий, в том числе технологий получения рекомбинантных рибонуклеиновых и дезоксирибонуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы.

4 Аппаратура, материалы и реактивы

4.1 Амплификатор типа "Терцик МС-2" под микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с [1]*.
_______________
* См. раздел Библиография. - Примечание изготовителя базы данных.

4.2 Прибор для горизонтального электрофореза типа "Mini-Sub Cell GT System" с комплектом кювет и гребенок [2].

4.3 Источник напряжения типа "Power Рас 300" с диапазоном регулируемого напряжения 50-300 В [3].

4.4 Видеосистема типа "Gel Doc 2000™", предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300-400 нм, чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию) [4].

4.5 Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.

4.6 Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 °С.

4.7 Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 12000 мин) [5]*.

4.8 Термостат типа "TERMO 24-15" под микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 см, диапазон температур от 15 °С до 120 °С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5 °С [6]*.
_______________
* См. раздел Библиография. Здесь и далее. - Примечание изготовителя базы данных.

4.9 Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250-3000 мин.

4.10 Печь микроволновая (мощностью не менее 400 Вт).

4.11 Весы лабораторные общего назначения высокого класса точности (условное обозначение ) с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

4.12 Баня водяная [7]*.
_______________
* См. раздел Библиография. - Примечание изготовителя базы данных.

4.13 рН-метр с набором электродов, с погрешностью ±0,1 рН.

4.14 Дозаторы с переменным объемом дозирования:

0,2-2,0 мм, шагом 0,01 мм, точностью ±1,2%;

0,5-10,0 мм, шагом 0,01 мм, точностью ±0,8%;

2-20 мм, шагом 0,01 мм, точностью ±0,8%;

20-200 мм, шагом 0,1 мм, точностью ±0,6%;

100-1000 мм, шагом 1 мм, точностью ±3%;

2-10 см, шагом 0,1 см, точностью ±0,5%.

4.15 Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 см.

4.16 Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000 мм; 10 см.

4.17 Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25; 50; 100; 200; 1000 см по ГОСТ 12738.

4.18 Цилиндры стеклянные мерные лабораторные на 25; 100; 1000 см по ГОСТ 1770.

4.19 Пестик тефлоновый или стеклянная палочка по ГОСТ 21400 под размер микроцентрифужной пробирки вместимостью 1,5 см.

4.20 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.21 Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

4.22 Кислота борная по ГОСТ 9656, х.ч.

4.23 Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч. [8]*.
_______________
* См. раздел Библиография. Здесь и далее. - Примечание изготовителя базы данных.

4.24 Гексадецилтриметиламмониум бромид [9].

4.25 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.

4.26 Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.

4.27 Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652, х.ч.

4.28 Спирт изопропиловый, х.ч. [10]*.

4.29 Масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164.

4.30 Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч.

4.31 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.32 Вода деионизированная [11].

4.33 Трис (оксиметил) аминометан, х.ч. [12]*.

4.34 2-меркаптоэтанол, х.ч. [13]*.

4.35 Этидий бромистый, х.ч. [14]*.
_______________
* См. раздел Библиография. Здесь и далее. - Примечание изготовителя базы данных.

4.36 Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА) [15].

4.37 Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70 °С - 72 °С [16].

4.38 ПЦР буфер [17].

4.39 Агароза для электрофореза (тип II) [18].

4.40 Маркер молекулярной массы ДНК [19].

4.41 Стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0) [20].

4.42 Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5) [21].

4.43 Нуклеотиды:

2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ) [22];

2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ) [23];

2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ) [24];

2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ) [25].

4.44 Праймеры на промотор 35S [26]:

35S-1 5'GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС A 3';

35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT СА 3'.

4.45 Праймеры на терминатор nos [27]:

nos-1 5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3';

nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3'.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных выше.

5 Отбор проб

Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья и пищевых продуктов.

6 Подготовка к проведению анализа

6.1 Приготовление растворов

6.1.1 Приготовление раствора концентрацией (Трис-)=1 моль/дм

В мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 см помещают 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана по 4.33, [12] растворяют в приблизительно 80 см деионизированной воды по 4.32, [11]. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят рН раствора до 7,5, затем доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.2 Приготовление раствора концентрацией ()=5 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 29,22 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в приблизительно 80 см деионизированной воды, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.3 Приготовление раствора концентрацией ()=30%

В колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 50 см помещают 3 г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, растворяют в 7 см деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.4 Приготовление раствора концентрацией (ЭДТА)=0,5 моль/дм

В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 14,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты по 4.23, [8], растворяют в приблизительно 80 см деионизированной воды. Раствором гидроокиси натрия, приготовленным по 6.1.3, доводят рН раствора до 8,0, деионизированной водой доводят до метки и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.5 Приготовление лизирующего буфера

В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 25 см помещают 0,5 г бромида гексадецилтриметиламмония, растворяют в 10 см деионизированной воды, добавляют автоматическим микродозатором 2,5 см раствора Трис-, приготовленного по 6.1.1, 7 см раствора хлористого натрия, приготовленного по 6.1.2, 1 см раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.4, доводят деионизированной водой до метки, перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес. В случае выпадения осадка при хранении раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате по 4.8, [6] при температуре 65 °С до полного растворения.

Непосредственно перед использованием в приготовленный раствор добавляют автоматическим микродозатором меркаптоэтанол по 4.34, [13] из расчета 4 мм на 1 см лизирующего буфера и перемешивают.

6.1.6 Приготовление хлороформа, насыщенного водой

В колбу вместимостью 200 см вносят цилиндром по ГОСТ 1770 100 см хлороформа по ГОСТ 20015, добавляют 20 см деионизированной воды по ГОСТ 6709, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч для насыщения.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.7 Приготовление 70%-ного раствора этилового ректификованного спирта

В колбу вместимостью 200 см вносят цилиндром 70 см 96%-ного этилового ректификованного спирта по ГОСТ Р 51652, добавляют 26 см деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.

6.1.8 Приготовление раствора концентрацией (БСА)=20 мкг/см

В пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см помещают 0,002 г сухого БСА по 4.36, [15], добавляют 1 см деионизированной воды, перемешивают до полного растворения. Отбирают 10 мм приготовленного раствора и переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см, добавляют 1 см деионизированной воды и перемешивают.

Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 °С - не более 1 мес.

6.1.9 Приготовление смеси нуклеотидов концентрацией =4 ммоль/дм

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,2 см вносят 96 мм деионизированной воды, 1 мм АТФ (концентрацией 100 ммоль/дм) по 4.43, [22], 1 мм ГТФ (концентрацией 100 ммоль/дм) по 4.43, [24], 1 мм ЦТФ (концентрацией 100 ммоль/дм) по 4.43, [23], 1 мм ТТФ (концентрацией 100 ммоль/дм) по 4.43, [25], смесь перемешивают.

Срок хранения при температуре минус 20 °С - не более одного года.

6.1.10 Приготовление 1xTBE буфера для электрофореза

В мерную колбу вместимостью 1000 см вносят 10,8 г Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты по ГОСТ 9656 и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают до полного растворения.

Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

6.1.11 Приготовление раствора концентрацией ()=10 мг/см

В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 1 г бромистого этидия по 4.35, [14], растворяют и доводят до метки дистиллированной водой.

Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 12 мес.

6.1.12 Приготовление 2%-ного агарозного геля

6.1.12.1 В плоскодонную стеклянную колбу вместимостью не менее 200 см помещают 1 г агарозы по 4.39, [18], добавляют 50 см буфера 1xTBE, приготовленного по 6.1.10, тщательно перемешивают взбалтыванием. Колбу со смесью нагревают в микроволновой печи по 4.10 или на водяной бане при температуре 100 °С и кипятят до полного расплавления агарозы.

6.1.12.2 Расплавленную агарозу, приготовленную по 6.1.12.1, охлаждают при комнатной температуре до 50 °С, автоматическим микродозатором добавляют 5 мм раствора бромистого этидия, приготовленного по 6.1.11, тщательно перемешивают круговыми движениями.

6.1.12.3 Однородную смесь, полученную по 6.1.12.2, разливают в кюветы для электрофореза и с помощью гребенки формируют карманы. Через 15-30 мин после остывания геля гребенку удаляют.

Допускается хранение геля в 1xTBE буфере для электрофореза, приготовленного по 6.1.10, в холодильнике при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 7 сут.

6.2 Подготовка пробы

6.2.1 Две навески анализируемого продукта, навеску стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0) пo 4.41, [20] и навеску стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5) пo 4.42, [21] массой от 70 до 80 мг каждая помещают в четыре микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 1,5 см. С помощью дозатора добавляют в каждую по 200 мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом по 6.1.5 и немедленно тефлоновым пестиком растирают смесь до получения однородной массы. В каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 600 мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом. Смесь тщательно перемешивают тефлоновым пестиком, не допуская образования комков. Затем смесь перемешивают в течение 30 с на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".

6.2.2 Приготовленные по 6.2.1 смеси помещают в термостат, инкубируют при температуре 65 °С 40-60 мин, после чего повторно перемешивают 30 с на аппарате для встряхивания и центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф по 4.7, [5] при частоте вращения 12000-13000 мин.

6.2.3 Надосадочную жидкость приготовленных по 6.2.2 смесей переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см, не захватывая частицы суспензии из осадка. Затем в каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 400 мм хлороформа, приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с до образования суспензии. Полученные суспензии центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 12000 минпри комнатной температуре.

6.2.4 Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.3, из четырех пробирок переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом и центрифугирование по 6.2.3 повторяют дважды.

6.2.5 Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.4, переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см, добавляют в каждую из них по 600 мм изопропилового спирта по 4.28, [10], предварительно охлажденного в морозильной камере до температуры минус 20 °С, и перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с.

Полученные смеси помещают в морозильную камеру температурой минус 20 °С не менее чем на 30 мин для образования осадка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

На данном этапе допускается хранение полученных смесей до 12 ч в морозильной камере при температуре минус 20 °С.

6.2.6 Смеси, приготовленные по 6.2.5, центрифугируют 6 мин при частоте вращения 12000 мин при комнатной температуре. Аккуратно удаляют надосадочную жидкость. Каждый осадок 2-3 раза промывают 200 мм 70%-ного этилового ректификованного спирта, приготовленного по 6.1.7, каждый раз перемешивая осадки на аппарате для встряхивания 15-20 с и центрифугируя их на микроцентрифуге 6 мин при частоте вращения 12000 мин. Тщательно (до последней капли) удаляют надосадочную жидкость.

6.2.7 Осадки, приготовленные по 6.2.6, растворяют в 50-100 мм деионизированной воды и получают раствор ДНК.

Растворы ДНК, приготовленные по 6.2.7, непосредственно используют для проведения ПЦР или хранят при температуре минус 20 °С сроком до одного года в морозильной камере.

6.3 Приготовление реакционных смесей N 1 и N 2

6.3.1 Приготовление реакционной смеси N 1 на пять проб

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 мм деионизированной воды, 52,5 мм 10х буфера для ПЦР с хлоридом магния по 4.38, [17], 26 мм смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм праймера на промотор 35S-1 (концентрацией 20 мкмоль/дм) по 4.44, [26], 13 мм праймера на промотор 35S-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм) по 4.44, [26], 2,5 мм фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм) по 4.37, [16], 52,5 мм раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

6.3.2 Приготовление реакционной смеси N 2 на пять проб

В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см, помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 мм деионизированной воды, 52,5 мм 10х буфера для ПЦР с хлоридом магния, 26 мм смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм праймера на терминатор nos-1 (концентрацией 20 мкмоль/дм) по 4.45, [27], 13 мм праймера на терминатор nos-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм) по 4.45, [27], 2,5 мм фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм), 52,5 мм раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.

6.3.3 Реакционные смеси N 1 и N 2, приготовленные по 6.3.1 и 6.3.2, центрифугируют на настольной микроцентрифуге 30 с при частоте вращения 3000 мин. Реакционную смесь N 1 разливают по 90 мм в пять микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см (или 0,5 см в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционную смесь N 2 разливают по 90 мм в пять других микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см (или 0,5 см в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционные смеси N 1 и N 2 готовят непосредственно перед проведением ПЦР.

7 Проведение анализа

7.1 В первые две пробирки с реакционной смесью N 1 и в первые две пробирки с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из анализируемого продукта, приготовленный по 6.2.1.1-6.2.1.7, по 2 мм в каждую.

В третью пробирку с реакционной смесью N 1 и в третью пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0), no 2 мм в каждую.

В четвертую пробирку с реакционной смесью N 1 и в четвертую пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), пo 2 мм в каждую.

В пятую пробирку с реакционной смесью N 1 и в пятую пробирку с реакционной смесью N 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 мм в каждую - холостой опыт.

7.2 В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, не перемешивая, по одной капле (20-40 мм) вазелинового масла по ГОСТ 3164.

7.3 Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амплификатор для проведения ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на терминатор nos - в таблице 2.


Таблица 1 - Условия амплификации для 35S промотора

Стадия	Тип амплификатора
	Crocodile II	Gene Amp 2400	Progene	Trio	Терцик МС-2
Денатурация	2 мин/98 °С	3 мин/94 °С	3 мин/95 °С	2 мин/96 °С	3 мин/94 °С
Амплификация	8 с/95 °С	20 с/94 °С	36 с/95 °С	30 с/95 °С	20 с/94 °С
	30 с/54 °С	40 с/54 °С	72 с/54 °С	40 с/54 °С	40 с/54 °С
	40 с/72 °С	60 с/72 °С	84 с/72 °С	40 с/72 °С	60 с/72 °С
Количество циклов	40	40	40	40	40
Конечное удлинение	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С
Фаза остывания	1 мин/30 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С
Скорость нагрева	1 °С/с	0,77 °С/с	1,5 °С/с	1 °С/с	0,77 °С/с
Скорость остывания	1 °С/с	3,15 °С/с	1,5 °С/с	1 °С/с	3,15 °С/с

Таблица 2 - Условия амплификации для терминатора nos

Стадия	Тип амплификатора
	Crocodile II	Gene Amp 2400	Progene	Trio	Терцик МС-2
Денатурация	3 мин/95 °С	3 мин/94 °С	3 мин/95 °С	2 мин/98 °С	3 мин/94 °С
Амплификация	20 с/95 °С	20 с/94 °С	36 с/95 °С	30 с/95 °С	20 с/94 °С
	40 с/54 °С	40 с/54 C	72 с/54 °С	40 с/54 °С	40 с/54 °С
	40 с/72 °С	60 с/72 °С	84 с/72 °С	40 с/72 °С	60 с/72 °С
Количество циклов	40	40	40	40	40
Конечное удлинение	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С	3 мин/72 °С
Фаза остывания	1 мин/30 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С	1 мин/4 °С
Скорость нагрева	1 °С/с	0,77 °С/с	1,5 °С/с	1 °С /с	0,77 °С/с
Скорость остывания	1 °С/с	3,15 °С /с	1,5 °С/с	1 °С/с	3,15 °С/с

7.4 По окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 мм смеси и переносят в отдельный карман геля, приготовленного по 6.1.12.

7.5 В отдельный карман геля вносят 8 мм маркера молекулярной массы ДНК по 4.40, [19].

7.6 Гель помещают в камеру прибора по 4.2, [2] для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1хТБЕ.

Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин.

7.7 Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы по 4.4, [4].

7.8 Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер. Примеры изображений приведены в приложениях А и Б.

8 Обработка результатов анализа

8.1 В пробе со стандартом ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), содержащего промотор 35S] должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п.н.). В пробе со стандартом без ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0)] и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п.н.).

8.2 В пробе со стандартом ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), содержащего терминатор nos] должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п.н. В пробе со стандартом без ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения состава (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0)] и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п.н.

8.3 Интерпретация результатов

8.3.1 Отсутствие в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.

8.3.2 Обнаружение в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н., или одного из них, свидетельствует о наличии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.

8.3.3 В случае обнаружения в одной из параллельно анализируемых проб и отсутствия в другой из параллельно анализируемых проб ПЦР-продуктов необходимо повторить весь анализ с еще одной навеской анализируемого продукта.

8.3.4 Обнаружение в отрицательных контролях ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует о получении ложноположительного результата. Это возможно при загрязнении ГМИ оборудования и/или реактивов. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и дозаторов раствором соляной кислоты (1 моль/дм), заменить реактивы на свежеприготовленные, повторить амплификацию.

8.3.5 Отсутствие в положительном контроле ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Это возможно в случае потери активности одного из компонентов реакционной смеси для ПЦР. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить амплификацию.

9 Контроль результатов идентификации

Для контроля результатов идентификации используют положительный контроль - раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), и два отрицательных контроля - холостой опыт и раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0).

10 Требования безопасности

10.1 При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007. При работе с раствором бромистого этидия и окрашенным гелем необходимо работать в резиновых перчатках.

10.2 Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.

10.3 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. При работе с УФ-излучением необходимо пользоваться защитным экраном и защитными очками.

Приложение А (обязательное). Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (промотор 35S)

Приложение А
(обязательное)

1, 2 - анализируемые пробы; 3 - маркер молекулярной массы 100 п.н.; 4 - стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения; 5 - стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения; 6 - холостой опыт

Приложение Б (обязательное). Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (терминатор nos)

Приложение Б
(обязательное)

1 - маркер молекулярной массы 100 п.н.; 2, 3 - анализируемые пробы; 4 - стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения; 5 - стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения; 6 - холостой опыт

Приложение В (справочное). Библиография

Приложение В
(справочное)

[1] ТУ 9642-001-4648062-98*		Амплификатор "Терцик МС-2"
________________ * ТУ, упомянутые здесь и далее по тексту, не приводятся. За дополнительной информацией обратитесь по ссылке. - Примечание изготовителя базы данных.
[2] "Био-Рад Лаборатория", "Bio-Rad Laboratories" (США), кат. N 170-4406		Камера для электрофореза "Mini-Sub Cell GT System"
[3] "Био-Рад Лаборатория", "Bio-Rad Laboratories" (США), кат. N 900-7980		Источник напряжения "Power Рас 300"
[4] "Био-Рад Лаборатория", "Bio-Rad Laboratories" (США), кат. N 170-86-16		Видеосистема "Gel Doc 2000™ Gel Documentation System"
[5] ТУ 9452-007-18240041-00		Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф "ТЭТА", 12000 мин
[6] ТУ 9452-001-18240041-99		Термостат "TERMO 24-15"
[7] ТУ 46-22-603-75		Баня водяная с электрическим или огневым подогревом
[8] ТУ 113-04-146-84		Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)
[9] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N H 5882		Гексадецилтриметиламмониум бромид []
[10] ТУ 6-09-402-85		Спирт изопропиловый []
[11] ОСТ 11.029.003-80		Вода деионизированная
[12] ТУ 6-09-4292-76		Трис (оксиметил)аминометан []
[13] ТУ 6-09-08-1024-81		2-меркаптоэтанол []
[14] ТУ 6-09-13-452-75		Этидий бромистый []
[15] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N В 4287		Альбумин бычий сывороточный сухой
[16] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N Д 1806		Фермент Taq-полимераза
[17] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N Р 2192		Буфер для ПЦР с
[18] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N А 6877		Агароза для электрофореза
[19] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N Р 1473		ПЦР маркер 100 п.н.
[20] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Fluka"), кат. N 53198		Стандартный образец состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0)
[21] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Fluka"), кат. N 44386		Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5)
[22] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N Д 4788		2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ)
[23] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N Д 4913		2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ)
[24] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N Д 5038		2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ)
[25] Корпорация "Сигма Алдрич" ("Sigma"), кат. N Т 9656		2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ)
[26] ЗАО "Синтол" Россия (http://www.syntol.ru)		Праймеры на промотор 35S:
		35S-1 5'GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС А 3';
		35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3'
[27] ЗАО "Синтол" Россия (http://www.syntol.ru)		Праймеры на терминатор NOS:
		nos-1 5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3';
		nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3'

УДК 663/664.001.4:006.354

ОКС

65.140 65.160 67.060 67.080 67.100 67.120 67.140 67.140.30 67.160.20 67.180.20 67.200.20 67.220 67.230

Н11 Н13 Н17 Н23 Н27 Н31-Н36 Н41-Н43 Н48 Н51-Н56 Н65 Н68 Н72 Н74 Н81 Н97

C11-C13 С21 С23-С35 С32-С36 С41-С45 С52

ОКСТУ

9109 9209 9709

Ключевые слова: пищевое сырье, продукты пищевые, генетически модифицированные источники, индентификация, метод полимеразной цепной реакции, рекомбинантная ДНК, праймер для промотора, праймер для терминатора
_________________________________________________________________________________________________________