ГОСТ Р 52147-2003 - Белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки. Методы определения содержания ретинола-ацетата (витамина А), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина Е)

ГОСТ Р 52147-2003

Группа С19

ОКС 65.120
ОКСТУ 9209

Дата введения 2005-01-01

1 РАЗРАБОТАН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (ОАО "ВНИИКП");

Всероссийским научно-исследовательским и технологическим институтом птицеводства (ВНИТИП);

Всероссийским научно-исследовательским институтом кормов им. В.Р.Вильямса (ВНИИК)

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 3 декабря 2003 г. N 342-ст

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки и устанавливает хроматографические методы определения ретинола-ацетата (витамина А), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина Е)

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4147-74 Железо (III) хлорид 6-водный. Технические условия

ГОСТ 4166-76 Натрий сернокислый. Технические условия

ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 9736-91 Приборы электрические прямого преобразования для измерения неэлектрических величин. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия

ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол). Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия

3 Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями.

3.1 Содержание витамина А: Содержание ретинола-ацетата, определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в международных единицах в 1 кг испытуемой пробы (МЕ/кг). 1 ME витамина А соответствует 0,344 мкг ретинола-ацетата.

3.2 Содержание витамина Е: Содержание токоферола-ацетата, определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в миллиграммах в 1 кг (мг/кг) испытуемой пробы.

3.3 Содержание витамина D: Содержание эргокальциферола (витамина ) или холекальциферола (витамина ), определенное в соответствии с настоящим стандартом и выраженное в международных единицах в 1 кг испытуемой пробы (МЕ/кг). 1 ME витамина D соответствует 0,025 мкг эргокальциферола (холекальциферола).

4 Диапазоны измерений содержания витаминов и характеристики погрешности измерений

Диапазоны измерений содержания витаминов и характеристики погрешности измерений приведены в таблице 1.

Таблица 1

Наименование витамина и его единица измерения	Вид хроматографии	Диапазон измерений содержания витамина	Границы относительной погрешности, %, () =0,95
Витамин А, тыс. МЕ/кг	Колоночная	5,0 до 50 включ.	±25
		50 " 100 "	±20
		" 100 " 300 "	±15
	ВЭЖ	5,0 до 100 включ.	±20
		" 300 "	±15
Витамин Е, мк/кг	Колоночная	10 до 500 включ.	±20
		" 1000 "	±15
	ВЭЖ	10 до 100 включ.	±20
		" 1000 "	±15
Витамин D, тыс. МЕ/кг	ВЭЖ	5,0 до 20 включ.	±20
		" 50 "	±15

5 Требования техники безопасности

5.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на фотоэлектроколориметр, спектрофотометр и хроматограф.

5.2 Помещение, в котором проводят измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить в вытяжном шкафу.

5.3 При работе с газовыми баллонами необходимо руководствоваться НД [1].

6 Подготовка проб к испытанию

6.1 Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.

6.2 Измельчение пробы

6.2.1 Оборудование:

мельница лабораторная электрическая, обеспечивающая измельчение пробы до прохода остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм;

сито с отверстиями диаметром 1 мм.

6.2.2 Из средней пробы исследуемого продукта методом квартования выделяют часть пробы массой не менее 100 г и измельчают на лабораторной мельнице до такого состояния, чтобы весь продукт проходил через сито с отверстиями диаметром 1 мм без остатка. Размолотую пробу тщательно перемешивают.

7 Определение содержания ретинола-ацетата (витамина А) и токоферола-ацетата (витамина Е) фотометрическим методом

Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром, разделении витаминов хроматографией на колонке с окисью алюминия и количественном определении витаминов фотометрическим методом.

7.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные высокого класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.

Спектрофотометр типа СФ-26, СФ-46 со спектральным диапазоном работы 186-1100 нм, основной погрешностью измерений коэффициента пропускания не более 1%, градуировкой длин волн в ультрафиолетовой (УФ) области - не более 0,1 нм.

Фотоэлектроколориметр с пределом измерений оптической плотности от 0 до 2, основной погрешностью измерений не более 1% и светофильтром длиной волны =(520±25) нм.

Холодильник бытовой по ГОСТ 16317.

Баллон с азотом рабочим давлением от 40 до 60 кг/см (от 4 до 6 МПа) [1].

Испаритель ротационный диапазоном измерения рабочего давления от 7 до 760 мм рт.ст. (от 9·10 до 10·10 Па) или насос водоструйный по ГОСТ 25336.

Баня водяная с регулятором нагрева.

Термометр жидкостный по ГОСТ 28498.

Печь муфельная электрическая, обеспечивающая поддержание температуры от 0 до 800 °С с погрешностью ±10 °С по ГОСТ 9736.

Секундомер [2].

Чашки выпарительные фарфоровые диаметром 123 мм по ГОСТ 9147.

Щипцы для тиглей муфельные.

Лампа ультрафиолетовая со светофильтрами =260-350 нм.

Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание температуры от 0 °С до 110 °С с погрешностью ±2 °С [3].

Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.

Колбы конические со шлифом -1-100(250)-24/29 по ГОСТ 25336.

Колбы мерные 1(2)-50(100, 200)-2 по ГОСТ 1770.

Воронки делительные вместимостью 250, 500 см по ГОСТ 25336.

Цилиндры мерные 1(2, 2а, 3, 4, 4а)-25(100, 250)-2 по ГОСТ 1770.

Воронки для фильтрования ВФ-1-56(75)ХС по ГОСТ 25336.

Пипетки с одной отметкой 1-2-0,5(1,2) по ГОСТ 29169.

Пипетки градуированные 1(2, 3, 5)-1(1а, 2, 2а)-2-0,5(1, 2, 5) по ГОСТ 29227.

Пробирки мерные с притертыми пробками П-1(2)-5(10)-0,1(0,2)ХС по ГОСТ 1770.

Склянки из темного стекла.

Колбы с тубусом вместимостью 250 см по ГОСТ 25336.

Колбы круглодонные К-1-100(250)-14/23(19/26) по ГОСТ 25336.

Колонки стеклянные для хроматографии размером 10х200 мм.

Эксикатор по ГОСТ 25336, заправленный хлористым кальцием, прокаленным при температуре 250-300 °С в течение 2 ч.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026 или фильтры [4].

Вата обезжиренная, готовят по ГОСТ 4517.

Палочки деревянные.

Витамин Е фармакопейный [5].

Спирт этиловый абсолютированный [6] или приготовленный по ГОСТ 4517.

Железо хлорное, раствор массовой долей около 0,2% в абсолютированном этиловом спирте.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363, раствор массовой долей 50%.

Натрий сернокислый по ГОСТ 4166, безводный.

Алюминия окись, безводная [7].

Эфир петролейный, фракция (40-70) °С, не содержащая ненасыщенные и ароматические углеводороды.

Эфир диэтиловый фармакопейный, не содержащий пероксидные соединения (испытание на отсутствие пероксидных соединений - по ГОСТ 4517).

Пирогаллол или гидрохинон по ГОСТ 19627.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652.

-фенантролин или , -дипиридил, раствор массовой долей около 0,5% в абсолютированном этиловом спирте.

Кислота аскорбиновая [8].

Фенолфталеин [9], спиртовый раствор массовой долей 1%.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Примечания

1 Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

2 Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

7.2 Подготовка к испытанию

7.2.1 Приготовление раствора хлорного железа массовой долей около 0,2% в абсолютированном спирте.

Навеску реактива массой 0,2 г растворяют в 99,8 см абсолютированного этилового спирта.

Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.

7.2.2 Приготовление раствора -фенантролина или , -дипиридила массовой долей около 0,5% в абсолютированном этиловом спирте

Навеску реактива массой 0,500 г растворяют в 99,5 см абсолютированного этилового спирта.

Раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла не более 7 сут.

7.2.3 Приготовление безводного сернокислого натрия

Реактив высушивают в сушильном шкафу при температуре (105±2) °С в течение 3 ч, хранят в склянке с притертой пробкой.

7.2.4 Приготовление окиси алюминия

Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (400±10) °С в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 97 г реактива добавляют 3 см дистиллированной воды и тщательно перемешивают.

После отстаивания в течение не менее 3 ч реактив годен к использованию.

Реактив хранят в склянке с притертой пробкой.

7.2.5 Приготовление раствора -токоферола массовой концентрации 1 мг/см

Навеску токоферола-ацетата массой 0,1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см добавляют от 100 до 200 мг аскорбиновой кислоты, 50 см этилового спирта и 10 см раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают в водяной бане при температуре (85±2) °С в течение 25 мин. Затем содержимое колбы быстро охлаждают под струей водопроводной воды до комнатной температуры, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см, приливают по 50 см дистиллированной воды и диэтилового эфира, встряхивают и отстаивают до разделения слоев.

После расслаивания нижний водно-спиртовый слой сливают в коническую колбу, а эфирный слой оставляют в делительной воронке. В коническую колбу приливают 50 см диэтилового эфира, встряхивают, отстаивают и после расслаивания верхний эфирный слой присоединяют к эфирному экстракту в делительной воронке, а к водно-спиртовому слою в конической колбе снова приливают 50 см диэтилового эфира и проводят экстракцию, как было указано выше. После расслаивания эфирный слой из конической колбы снова присоединяют к экстракту в делительной воронке.

Объединенные эфирные экстракты промывают дистиллированной водой порциями по 30 см до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (10-15 г). После окончания фильтрации сернокислый натрий три раза промывают порциями (по 20-30 см) диэтилового эфира. Эфир отгоняют в водяной бане при температуре не выше 50 °С в токе азота или под вакуумом, используя водоструйный насос или роторный испаритель.

К сухому остатку приливают 10-15 см абсолютированного этилового спирта, количественно переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят объем в колбе до метки этим же спиртом и тщательно перем

ешивают.

7.2.6 Приготовление раствора -токоферола массовой концентрации 20 мкг/см

1 см раствора -токоферола массовой концентрации 1 мг/см переносят в мерную колбу вместимостью 50 см, доводят объем в колбе абсолютированным спиртом до метки и тщательно перемешивают.

В полученном растворе проверяют массовую концентрацию -токоферола и его чистоту, снимая спектр в пределах 260-310 нм на спектрофотометре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно абсолютированного этилового спирта. Чистый -токоферол имеет симметричный пик максимумом поглощения при длине волны 292 нм.

Массовую концентрацию -токоферола в растворе , мкг/см, вычисляют по формуле

ГОСТ Р 52147-2003 Белково-витаминно-минеральные и амидо-витаминно-минеральные добавки. Методы определения содержания ретинола-ацетата (витамина А), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина Е) , (1)

где - оптическая плотность раствора при длине волны 292 нм;

- коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

- оптическая плотность раствора -токоферола в абсолютированном этиловом спирте массовой концентрации 1 г в 100 см при длине волны 292 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для -токоферола =75)

7.2.7 Построение градуировочного графика для определения токоферола-ацетата (витамина Е)

В пять мерных пробирок вместимостью по 5 см приливают 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 см раствора -токоферола массовой концентрации 20 мкг/см. В первые четыре пробирки добавляют 3,5; 3,0; 2,0 и 1,0 см абсолютированного этилового спирта. Затем в пробирки добавляют по 0,5 см раствора -фенантролина и по 0,5 см раствора хлорного железа, перемешивают. Ставят опытную пробу в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптические плотности испытуемых растворов в порядке возрастания их концентрации на фотоэлектроколориметре в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при длине волны (520±25) нм относительно абсолютированного этилового спирта. Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения -токоферола.

По полученным данным строят градуировочный график, откладывая на оси ординат значения разности оптической плотности испытуемых растворов и контрольного раствора, на оси абсцисс - содержание -токоферола, мкг/5 см (10, 20, 40, 60 и 80 мкг/

5 см)

7.2.8 Приготовление элюирующих растворов

7.2.8.1 Приготовление раствора I

В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 6 см диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

7.2.8.2 Приготовление раствора II
В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 12 см диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

7.2.8.3 Приготовление раствора III

В мерную колбу вместимостью 100 см вносят 30 см диэтилового эфира и объем жидкости в колбе доводят до метки петролейным эфиром, перемешивают.

7.3 Проведение испытаний

Из-за высокой чувствительности витаминов к ультрафиолетовому свету и воздуху все процедуры, связанные с анализом, следует завершить в течение одного рабочего дня, избегая воздействия натурального и интенсивного флуоресцентного света.

7.3.1 Омыление и экстракция

Навеску исследуемого продукта массой 4,00-5,00 г помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см, приливают 50 см этилового спирта, 10 см раствора гидроокиси калия массовой долей 50% и добавляют 40-50 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля).

Колбу соединяют с обратным холодильником, помещают в водяную баню и нагревают при температуре (85±2) °С в течение 25 мин, периодически перемешивая содержимое колбы. После этого содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры.

Затем в колбу приливают 20-25 см дистиллированной воды, 50 см диэтилового эфира, перемешивают, жидкую часть сливают в делительную воронку вместимостью 500 см, сохраняя осадок в колбе. Экстракцию витаминов диэтиловым эфиром проводят трижды по 7.2.5.

При образовании устойчивой эмульсии в делительную воронку добавляют 20 см этилового спирта.

В объединенный эфирный экстракт добавляют несколько кристаллов бутилокситолуола и промывают его дистиллированной водой порциями по 100 см до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с фенолфталеином. Затем экстракт переносят в круглодонную колбу, пропуская его через бумажный фильтр со слоем безводного сернокислого натрия (30-50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают 40 см диэтилового эфира. Эфир выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 50 °С в токе азота или под вакуумом на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в 4 см петролейного эфира.

Примечание - Допускается для экстракции применять петролейный эфир.

7.3.2 Подготовка хроматографической колонки

В нижнюю часть колонки помещают кусочек ваты, затем активированную окись алюминия, уплотняя ее постукиванием по колонке деревянной палочкой до высоты сорбента 7 см. Сверху помещают слой безводного сернокислого натрия высотой 1 см.

В колбу с тубусом вставляют резиновую пробку, через сквозное отверстие которой проходит утонченный конец хроматографической колонки. Через колонку при вакууме, создаваемом с помощью водоструйного насоса пропускают петролейный эфир до полного смачивания слоя окиси алюминия (около 15 см).

Промывание колонки проводят со скоростью одна капля в секунду, не допуская при этом высыхания верха колонки и просасывания воздуха.

7.3.3 Хроматографическое разделение ретинола и -токоферола

4 см раствора экстракта испытуемого продукта, полученного по 7.3.1, помещают в колонку, подготовленную по 7.3.2, не допуская высыхания верха колонки. Промывают колонку 15 см элюирующего раствора I. Эту фракцию отбрасывают.

-токоферол элюируют от 15 до 25 см раствора II, контролируя продвижение витамина в УФ свете (-токоферол имеет голубоватое свечение).

Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см.

К колонке присоединяют другую колбу с тубусом и элюируют ретинол 30-35 см раствора III, также контролируя продвижение витамина в УФ-свете (ретинол имеет желто-зеленое свечение). Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см и выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 50 °С в токе азота или под вакуумом.

Сухой остаток растворяют в 5-50 см абсолютированного этилового спирта в зависимости от предполагаемого содержания витамин

а А.

7.3.4 Оптическую плотность полученного раствора ретинола измеряют на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно абсолютированного этилового спирта.

7.3.5 Проведение цветной реакции с раствором -токоферола

Собранный и перенесенный в коническую колбу элюат -токоферола выпаривают досуха на водяной бане при температуре не выше 50 °С в токе азота или под вакуумом. Остаток растворяют в 10 см абсолютированного этилового спирта. Ориентируясь на рецептуру добавки, берут 0,2-3,5 см раствора и переносят в кювету толщиной поглощающего свет слоя 10 мм или в мерную пробирку вместимостью 5 см, добавляют соответственно от 3,8 до 0,5 см абсолютированного этилового спирта, 0,5 см раствора -фенантролина и 0,5 см раствора хлорного железа. Опытную пробу ставят в темное место на 5 мин для развития окраски. По истечении времени измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на фотоэлектроколориметре при длине волны (520±25) нм относительно абсолютированного этилового спирта.

Одновременно проводят контрольное испытание на реактивы без внесения -токоферо

ла.

7.4 Обработка и оформление результатов

7.4.1 Содержание ретинола-ацетата , МЕ/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

, (2)

где 18,3 - массовая концентрация раствора ретинола в абсолютированном этиловом спирте, имеющего оптическую плотность, равную 1, при длине волны 326 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см, МЕ/см;

- объем элюата (5-50), см;

- оптическая плотность раствора;

10 - коэффициент пересчета граммов в килограммы;

- масса навески, г;

1,15 - коэффициент пересчета ретинола в ретинол-ацетат.

7.4.2 Содержание токоферола-ацетата , мг/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

где - масса -токоферола, найденная по градуировочному графику, мкг;

- объем раствора элюата (10), см;

10 - коэффициенты пересчета микрограммов в миллиграммы и граммов в килограммы;

1,1 - коэффициент пересчета -токоферола в ацетатную форму;

- масса навески, г;

- объем раствора, взятый для проведения цветной реакции (0,2-3,5), с

м.

7.4.3 Результат вычисляют до третьей значащей цифры и округляют до двух значащих цифр.

7.4.4 При анализе каждой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы. Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает допустимое , где , и - результат первого и второго параллельных определений и их среднеарифметическое значение соответственно, то среднеарифметическое значение принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют.

Если расхождения между параллельными определениями вновь превышают регламентируемые допуски, выясняют и устраняют причины плохой сходимости результатов анализа.

Значения приведены в таблице 2.

Таблица 2

Наименование витамина и единица	Вид хроматографии	Диапазон измерений массовой доли	Значение норматива контроля, %, =0,95
измерения		витамина	сходимости , =2	воспро- изводимости , =2
Витамин А, тыс. МЕ/кг	Колоночная	5,0 до 50 включ.	20	35
		50 " 100 "	15	25
		" 100 " 300 "	10	20
	ВЭЖ	5,0 до 100 включ.	15	25
		" 300 "	10	20
Витамин Е, мг/кг	Колоночная	до 100 включ.	15	30
		" 500 "	10	25
		500 " 1000 "	10	20
	ВЭЖ	10 до 100 включ.	12	28
		" 1000 "	8	20
Витамин D, тыс. МЕ/кг	ВЭЖ	5,0 до 20 включ.	20	30
		" 50 "	12	22

По полученному результату анализа и значению относительной погрешности (таблица 1) рассчитывают абсолютную погрешность по формуле

Результат анализа представляют в виде МЕ/кг или мг/кг при =0,95.

8 Определение содержания ретинола-ацетата (витамина А), эргокальциферола (холекальциферола) (витамина D), токоферола-ацетата (витамина Е) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Сущность метода заключается в омылении образца водно-спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витаминов диэтиловым эфиром с последующим определением витаминов на жидкостном хроматографе.

При содержании витамина D в испытуемом продукте менее 10 МЕ/г перед проведением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) необходима очистка экстракта на колонке с окисью алюминия по 8.3.2. Анализ проводят из отдельно взятой навески массой 10 г.

8.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы по 7.1 со следующим дополнением.

Хроматограф жидкостный "Милихром" с УФ-детектором со спектральным диапазоном 190-360 нм, обеспечивающий одновременное измерение на не менее 3 длинах волн с уровнем шумов не более 10 единиц оптической плотности (е.о.п.).

Колонка аналитическая хроматографическая для ВЭЖХ, размером 80 (64, 120)х2 мм, заполненная сорбентом Силасорб 600 (размер частиц 5 мкм) с эффективностью не ниже 5000 теоретических тарелок.

Прибор для перегонки при атмосферном давлении [10].

Ретинол-ацетат (витамин А) фармакопейный [11].

Эргокальциферол кристаллический (витамин ) [12] или холекальциферол кристаллический (витамин ) [13].

Спирт изопропиловый [14].

Гексан [15].

Алюминия окись для хроматографии [16].

2,6-Ди-трет-бутил-п-крезол (бутиолокситолуол) [17].

Примечание - Допускается применение других типов хроматографов, сорбентов и соответствующих им растворителей, обеспечивающих эффективное разделение исследуемых компонентов. При этом условия разделения витаминов подбираются самостоятельно каждым пользователем.

8.2 Подготовка к испытанию

8.2.1 Приготовление элюирующего раствора

Готовят смесь гексана с изопропиловым спиртом в объемном соотношении 98,5:1,5 (98:2)

8.2.2 Очистка изопропилового спирта

Изопропиловый спирт перегоняют над гидроокисью калия или натрия (10 г гидроокиси требуется для перегонки 1 дм спирта).

Реактив должен иметь оптическую плотность не более 0,1 е.о.п. при =320-350 нм относительно дистиллированной воды.

8.2.3 Приготовление окиси алюминия

Реактив прокаливают в муфельной печи при температуре (750±10) °С в течение 4 ч, охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе. К 91 г реактива добавляют 9 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают и хранят в посуде с притертой пробкой.

Годен для использования после отстаивания в течение 3 ч.

8.2.4 Приготовление безводного сернокислого натрия по 7.2.3

8.2.5 Приготовление растворов ретинола

8.2.5.1 Приготовление раствора ретинола массовой концентрации 1000 МЕ/см.

Навеску ретинола-ацетата, соответствующую 50000 ME препарата, помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 см, добавляют около 200 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля), 30 см этилового спирта и 5 см раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Колбу соединяют с обратным холодильником и проводят омыление в водяной бане при температуре (85±2) °С в течение 30 мин, охлаждают до комнатной температуры под струей водопроводной воды и добавляют 15 см дистиллированной воды. Затем содержимое колбы переносят в делительную воронку вместимостью 250 см, промывают колбу 20 см этилового спирта, который тоже переносят в делительную воронку. Добавляют 30 см смеси диэтилового эфира и гексана в объемном соотношении 1:1, полученную смесь тщательно перемешивают. После расслаивания нижний слой (водно-спиртовый) сливают в коническую колбу, а гексано-эфирный оставляют в делительной воронке. Эту операцию экстракции ретинола гексано-эфирной смесью из водно-спиртового слоя в конической колбе проводят еще дважды по 7.2.5, каждый раз сливая в делительную воронку гексано-эфирный слой. Объединенный экстракт в делительной воронке промывают дистиллированной водой порциями по 30 см до исчезновения розовой окраски промывных вод по реакции с раствором фенолфталеина. Промытый экстракт переносят в коническую колбу вместимостью 250 см, пропуская его через бумажный фильтр и слой безводного сернокислого натрия (40-50 г). Делительную воронку и фильтрующий материал промывают дважды порциями гексано-эфирной смеси (20-30 см). Экстракт выпаривают досуха в водяной бане при температуре не выше 60 °С в токе азота или под вакуумом на ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в гексане, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см, добавляют 100 мг бутилокситолуола, перемешивают, объем раствора в колбе доводят гексаном до метки и снова тщательно перемеш

ивают.

8.2.5.2 Приготовление градуировочных растворов ретинола массовой концентрации 20, 100 и 500 МЕ/см

В три мерные колбы вместимостью по 50 см помещают 1; 5 и 25 см раствора ретинола массовой концентрации 1000 МЕ/см, доводят объемы растворов в колбах до метки гексаном и тщательно перемешивают.

Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 326 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно гексана.

Массовую концентрацию ретинола в растворе , МЕ/см вычисляют по формуле

где - оптическая плотность раствора ретинола;

- коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

- оптическая плотность раствора ретинола в гексане массовой концентрации 1 г в 100 см при длине волны 326 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для ретинола =1830);

0,3 - коэффициент пересчета массы ретинола в ME, мкг/МЕ.

8.2.6 Приготовление растворов -токоферола

8.2.6.1 Приготовление раствора -токоферола массовой концентрации 1000 мкг/см

Навеску витамина Е массой 0,1120 г в расчете на содержание чистого вещества помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см и проводят омыление, экстракцию и обезвоживание по 7.2.5.

После выпаривания сухой остаток растворяют в 100 см гексана.

8.2.6.2 Приготовление градуировочных растворов -токоферола массовой концентрации 20, 100 и 500 мкг/см

В три мерные колбы вместимостью 50 см помещают 1; 5 и 25 см раствора -токоферола массовой концентрации 1000 мкг/см, доводят объем раствора в колбах до метки гексаном и тщательно перемешивают.

Массовые концентрации -токоферола в растворах проверяют спектрофотометрически по 7.2.6 и вычисляют по формуле 1

8.2.7 Приготовление растворов витамина D

8.2.7.1 Приготовление раствора витамина D массовой концентрации 20000 МЕ/см

Навеску кристаллического эргокальциферола (холекальциферола) массой 0,100 г помещают в мерную колбу вместимостью 200 см, растворяют в гексане, объем раствора в колбе доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.

8.2.7.2 Приготовление градуировочных растворов витамина D массовой концентрации 50 и 100 МЕ/см

В две мерные колбы вместимостью 200 см помещают 0,5 и 1,0 см раствора витамина D массовой концентрации 20000 МЕ/см. Объемы растворов в колбах доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.

Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 265 нм в кювете толщиной поглощающего свет слоя 1 см относительно гексана.

Массовую концентрацию витамина D в растворе , МЕ/см, вычисляют по формуле

где - оптическая плотность раствора витамина D;

- коэффициент пересчета граммов в микрограммы;

- оптическая плотность раствора витамина D в гексане массовой концентрации 1 г в 100 см раствора при длине волны 265 нм и толщине поглощающего свет слоя 1 см (для витамина =465; для витамина =500);

0,025 - коэффициент пересчета массы витамина D в ME, мкг/М

8.2.8 В растворы витаминов добавляют несколько кристаллов 2,6-ди-трет-бутил-п-крезола (бутиолокситолуола) и хранят в холодильнике не более 1 мес.

8.3 Проведение испытания

8.3.1 Омыление и экстракция

Навеску исследуемого продукта массой 5,00-10,00 г помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см, добавляют 100-150 мг пирогаллола или гидрохинона (на кончике скальпеля) и соответственно 50-70 см этилового спирта и 10-15 см раствора гидроокиси калия массовой долей 50%. Дальнейшую процедуру омыления и экстракции проводят по 7.3.1. Сухой остаток витаминов растворяют в 4 см гексана.

Примечание - Допускается для экстракции применять петролейный эфир.

8.3.2 Очистка раствора, полученного по 8.3.1, на колонке с окисью алюминия

8.3.2.1 Подготовка хроматографической колонки - по 7.3.2.

8.3.2.2 Элюирование витамина D

В колонку (8.3.2.1), не допуская высыхания верха колонки, вносят 4 см раствора (8.3.1) и промывают ее 20 см петролейного эфира и 4 см смеси петролейного и диэтилового эфира в объемном соотношении 1:1. Эту фракцию отбрасывают.

Витамин D элюируют 20 см смеси петролейного и диэтилового эфира в объемном соотношении 1:1. Элюат количественно переносят в коническую колбу вместимостью 50 см и выпаривают досуха в водяной бане под током азота при температуре (60±2) °С.

Сухой остаток растворяют в 1 см гексана.

Полученный раствор (далее испытуемый раствор) используют для ВЭЖХ.

8.3.3 Подготовка жидкостного хроматографа к работе

Подготовку прибора осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации.

Перед началом работы колонку промывают элюентом при скорости его подачи 100-200 мкдм/мин в течение 5-10 мин.

8.3.4 Выполнение измерений на хроматографе "Милихром"

8.3.4.1 Условия проведения измерений

Измерения проводят в следующих условиях:

а) разделение компонентов проводят на колонке размером 64 (80, 120)х2 мм;

б) сорбент - Силосорб 600;

в) элюент - гексан-изопропиловый спирт в объемном соотношении 98,5:1,5 (98:2);

г) рабочие длины волн УФ-детектора - 264, 292 и 324 нм (соответственно для витаминов D, Е, А);

д) скорость элюирования - 150-200 мкдм/мин;

е) объем анализируемого раствора - 10-40 мкдм для витамина D и 4-5 мкдм для витаминов А, Е.

8.3.4.2 Проведение измерений испытуемого раствора

Для измерений используют метод внешнего стандарта. В колонку хроматографа последовательно вводят равные объемы испытуемого и градуировочного растворов.

В качестве градуировочного выбирают раствор, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора.

Концентрация градуировочных растворов должна уточняться в день их использования по 8.2.5.2, 8.2.6.2 и 8.2.7.2.

Пик витамина на хроматограмме испытуемого раствора идентифицируют по времени удерживания.

Примеры хроматограмм экстрактов витаминов A, D, Е из белково-витаминно-минеральных добавок представлены в приложении А.

8.4 Обработка результатов

8.4.1 Содержание витаминов , витамина А - МЕ/кг, витамина Е - мг/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

где - концентрация используемых градуировочных растворов, МЕ/см (ретинол), мг/см (-токоферол);

- среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика испытуемого раствора для двух параллельных определений анализируемого компонента, мм или е.о.п.,
- объем разведения, см (4 см);

10 - коэффициент пересчета граммов в килограммы;

- коэффициент пересчета в ацетатную форму (для витамина А =1,15, для витамина Е =1,1);

- среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика градуировочного раствора для двух параллельных определений анализируемого компонента, мм или е.о.п.,

- масса навески испытуемой пробы, г.

Примечание - При расчете содержания витамина А высоты (площади) пиков испытуемого и градуировочного растворов рассчитывают как сумму высот (площадей) цис- и транс-формы р

етинола.

8.4.2 Содержание витамина D , МЕ/кг, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

где - концентрация используемого градуировочного раствора, МЕ/см;

- среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика испытуемого раствора для двух параллельных анализов, мм или е.о.п.;

- объем разведения, см (4 см);

10 - коэффициент пересчета граммов в килограммы;

1,15 - коэффициент, учитывающий превращение витамина D в провитамин;

- среднеарифметическое значение результатов измерений высоты (площади) пика градуировочного раствора для двух параллельных анализов, мм или е.о.п;

- масса навески испытуемой пробы, г.

При определении витамина D, если в качестве градуировочного вещества используют эргокальциферол (витамин ), то числитель в формуле дополнительно умножают на коэффициент 0

,97.

8.4.3 Результаты вычисляют до третьей значащей цифры и округляют до двух значащих цифр.

8.4.4 Контроль сходимости результатов параллельных определений и представление результатов по 7.4.4.

9 Контроль точности испытаний

9.1 Контроль сходимости результатов параллельных определений - по 7.4.4.

9.2 Для контроля воспроизводимости используют рабочие пробы. Каждую пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой настоящего стандарта, получают два результата испытаний в разных лабораториях или в одной, но выполненные разными исполнителями на разном оборудовании с использованием реактивов разных партий в разное время. Воспроизводимость считают удовлетворительной, если , где , и - результаты испытаний одной и той же пробы, полученные в двух разных лабораториях или в разных условиях в одной лаборатории, и их среднеарифметическое значение. Значение приведено в таблице 2.

9.3 Контроль точности выполняют методом добавок. Рабочую пробу делят на две равные части, первую из которых анализируют в соответствии с методикой, а во вторую вводят известную добавку витамина и затем анализируют в соответствии с методикой настоящего стандарта. Значение добавки должно составлять 50%-150% содержания витамина в испытуемой пробе. Точность контрольных испытаний признают удовлетворительной, если , где , и - результаты контрольных испытаний пробы с добавкой, без добавки и значение добавки. Значение норматива для вероятности =0,90 вычисляют по формуле

, (8)

где и - значения погрешности результатов анализа пробы без добавки и пробы с добавкой, вычисленные по 7.4.4.

Пример - Проведен анализ пробы с добавкой (=40 МЕ/кг) и без добавки (=30 МЕ/кг) на содержание витамина А. Значение добавки составляет =20 МЕ/кг, значение относительной погрешности =25%. Результат контрольного анализа равен:

Норматив контроля точности находят по формуле

Анализ выполнен с достаточной точностью, так как результат контрольного анализа меньше норматива контроля точности (10<10,5).

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное). Хроматограммы экстрактов витаминов A, D, Е

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)

Рисунок А.1 - Хроматограмма экстракта витамина А

Рисунок А.1 - Хроматограмма экстракта витамина А:
1 - цис-форма, 2 - транс-форма

Рисунок А.2 - Хроматограмма экстракта витамина D

Рисунок А.3 - Хроматограмма экстракта витамина Е

ПРИЛОЖЕНИЕ Б (справочное). Библиография

ПРИЛОЖЕНИЕ Б
(справочное)

[1] ПБ 10-115-96 Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением

[2] ТУ 25-1819.0021-90 Секундомеры механические "Слава"

[3] ТУ 64-1.1411-76 Шкаф сушильный

[4] ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)

[5] ГФ СССР-X ст.695 Токоферола-ацетат

[6] ТУ 84-11-99-89 Этиловый абсолютированный спирт

[7] МРТУ 6-09-426-70 Алюминия окись безводная

[8] ГФ СССР-X ст.6 Кислота аскорбиновая

[9] ТУ 6-09-53-60-87 Фенолфталеин (индикатор)

[10] Воскресенский П.И. Техника лабораторных работ. Химия М., 1969, стр.490

[11] ГФ СССР-X ст.579 Раствор ретинола-ацетата в масле 3,44%

[12] ФС 42-1764-96 Эргокальциферол кристаллический

[13] ФС 421046299 Витамин 1000000 МЕ/г субстанция (производитель "Хоффманн-Ля Рош", Швейцария)

[14] ТУ 6.09-402-87 2-пропанол (изопропиловый спирт химически чистый)

[15] ТУ 6-09-3375-78 Гексан

[16] ТУ 6-09-3916-85 Окись алюминия для хроматографии

[17] ТУ 6.09-10-9954-74 2,6-Ди-трет-бутил-п-крезол