ГОСТ Р 51116-97
Комбикорма, зерно, продукты его переработки. Метод определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина)

ГОСТ Р 51116-97

Группа С19

     
     
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОМБИКОРМА, ЗЕРНО, ПРОДУКТЫ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ

Метод определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина)

Compound feeds, grain and grain by-products.
Method for determination of desoxinivalenol (vomitoxin) content

ОКС 65.120
ОКСТУ 9209, 9709, 9809

Дата введения 1998-07-01

     
     
Предисловие

1 РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, БВД, премиксы", АООТ "Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности" (АООТ "ВНИИКП")

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 25 декабря 1997 года N 426

3 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

4 ПЕРЕИЗДАНИЕ

1 Область применения

     1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на зерно (пшеницу, кукурузу, ячмень, овес), продукты его переработки (муку, крупу, отруби и др.), комбикорма и устанавливает метод определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) с использованием жидкостного хроматографа "Милихром".

Сущность метода заключается в экстракции дезоксиниваленола (вомитоксина) из испытуемой пробы смесью ацетонитрила с водой, очистке экстракта на двух последовательных колонках с активированным углем и количественном определении дезоксиниваленола (вомитоксина) с помощью жидкостного хроматографа "Милихром" со спектрофотометрическим детектором на ультрафиолетовую область (далее с УФ-детектором) в двухволновом режиме.

Пределы определения в пробе - 0,2-4,0 мг/кг, в растворе - 1-20 нг/мкдм.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 24104-88* Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
________________
* С 1 июля 2002 года вводится в действие ГОСТ 24104-2001.

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26312.1-84 Крупа. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

3 Аппаратура, материалы и реактивы

Весы лабораторные общего назначения 3-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 20 г по ГОСТ 24104.

Мельница лабораторная электрическая типа ЭМ-3А, обеспечивающая измельчение пробы до прохода без остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, обеспечивающий частоту встряхивания 200 колебаний в минуту.

Хроматограф жидкостный "Милихром" с УФ-детектором со спектральным диапазоном 190-360 нм, обеспечивающий одновременное измерение на не менее двух длинах волн, уровень шумов не более 10 единиц оптической плотности (е.о.п.).

Спектрофотометр типа СФ-26, СФ-46 со спектральным диапазоном 186-1100 нм, основная погрешность измерений коэффициента пропускания не более 1%, градуировки длин волн в УФ области - не более 0,1 нм.

Колонка аналитическая хроматографическая для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) размером 80х2 мм, заполненная сорбентом диабонд С 16 с эффективностью не ниже 5000 теоретических тарелок (далее - т.т.).

Колонки хроматографические для жидкостной хроматографии (ЖХ) размером 100х5 мм с оттянутым концом и шарообразной верхней частью вместимостью 25 см.

Баллон с азотом.

Сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Испаритель ротационный марки ИР-2М или насос водоструйный.

Колбы мерные 1(2)-25(50, 100)-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры мерные 1(3)-25(100, 250) по ГОСТ 1770.

Колбы 0-25(50)-14/23 ТС по ГОСТ 25336.

Пробирки типа П1 по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-1-2-0,5(1, 2, 5, 10) по ГОСТ 29227.

Колбы плоскодонные конические с притертыми стеклянными или полиэтиленовыми пробками вместимостью 500 см.

Склянки из темного стекла с притертыми пробками.

Уголь активированный марки ФАС размером частиц от 0,08 до 0,10 мм по НД [1].

Фильтры бумажные обеззоленные марки ФОМ по НД [2].

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.

Метанол - яд по ГОСТ 6995.

Ацетонитрил для хроматографии с содержанием основного вещества не менее 99,5% (оптическая плотность ацетонитрила при длине волны 210 нм относительно воды должна быть не более 0,3 е.о.п.)

Дезоксиниваленол (вомитоксин) кристаллический массовой долей основного вещества не менее 90%.

Вода бидистиллированная электрическим сопротивлением не менее 12 МОм.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

4 Подготовка к испытанию

4.1. Отбор проб по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 26312.1, ГОСТ 27668.

Масса средней пробы исследуемого продукта должна быть не менее 2 кг.

4.2 Подготовка пробы к испытанию

Из средней пробы исследуемого продукта методом квартования выделяют часть пробы массой не менее 100 г и измельчают на лабораторной мельнице до такого состояния, чтобы она проходила без остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Выделенную часть размолотой пробы тщательно перемешивают.

Выделенную часть пробы муки используют для анализа без предварительного размалывания.

4.3 Приготовление элюирующих растворов

Приготавливают смеси ацетонитрила и воды в объемных соотношениях: 0,05:1; 0,125:1; 0,5:1; 1:1.

4.4 Приготовление исходного раствора дезоксиниваленола (вомитоксина)

Навеску кристаллического дезоксиниваленола (вомитоксина) массой (10±0,01) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем раствора бидистиллированной водой до метки.

Для определения массовой концентрации дезоксиниваленола (вомитоксина) в исходном растворе 3 см исходного раствора переносят в пробирку. Растворитель испаряют в токе азота или при вакууме с помощью водоструйного насоса при нагревании не выше 60 °С досуха. К остатку добавляют 3 см метилового спирта и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 218 нм в кюветах толщиной просвечиваемого слоя 10 мм относительно метилового спирта.

Массовую концентрацию дезоксиниваленола (вомитоксина) в исходном растворе , нг/мкдм, вычисляют по формуле

, (1)

где - оптическая плотность исходного раствора дезоксиниваленола (вомитоксина), е.о.п.;

296 - молекулярная масса дезоксиниваленола (вомитоксина), г;

4500 - коэффициент молярной экстинкции дезоксиниваленола (вомитоксина), дм/моль·см;

10 - коэффициент пересчета г в нг;

10 - коэффициент пересчета дм в мкдм.

4.5 Приготовление градуировочных растворов дезоксиниваленола (вомитоксина)

В мерные колбы вместимостью 100 см переносят исходный раствор дезоксиниваленола (вомитоксина) в объемах, указанных в таблице 1. Объем жидкости в колбах доводят до метки дистиллированной водой.


Таблица 1

Номер колбы	Объем исходного раствора дезоксиниваленола (вомитоксина), см	Массовая концентрация дезоксиниваленола (вомитоксина) в градуировочном растворе, (=1, 2, 3), нг/мкдм	Масса дезоксиниваленола (вомитоксина), вводимая в хроматограф с градуировочным раствором, (=1, 2, 3), нг
1	5
2	10
3	25

Градуировочные растворы хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном месте при температуре около 0 °С не более года.

4.6 Подготовка колонок для жидкостной хроматографии (ЖХ) для очистки экстракта

На дно двух хроматографических колонок (ЖХ) помещают промытые ацетонитрилом ватные тампоны. В одну колонку вносят (0,2±0,05) г (далее колонка 1), в другую - (0,1±0,05) г (далее колонка 2) активированного угля. Уплотняют при осторожном постукивании до высоты слоя, не изменяющейся при дальнейшем постукивании.

4.7 Кондиционирование ВЭЖХ колонки

Перед первыми анализами колонку кондиционируют, проводя 3-4 холостых опыта, т.е. проводят градиентное элюирование по 5.3 без введения в колонку пробы.

4.8 Градуировка прибора

Для градуировки прибора в колонку (ВЭЖХ) вводят по 4 мкдм градуировочных растворов и проводят хроматографирование по 5.3. Каждый градуировочный раствор вводят 3 раза. Для каждого пика определяют время удерживания (, мин), измеряют высоту пика (, мм) или е. о. п.

По полученным результатам устанавливают время удерживания дезоксиниваленола (вомитоксина) и погрешность времени удерживания. Среднее время удерживания , мин, вычисляют по формуле

, (2)

где - время удерживания для -го градуировочного раствора, мин;

- количество введенных в хроматограф градуировочных растворов (=9).

Среднеквадратичное отклонение значения времени удерживания , мин, вычисляют по формуле

. (3)

Границы абсолютной погрешности значения времени удерживания , мин, вычисляют по формуле

, (4)

где - критерий Стьюдента для числа степеней свободы (=0,95). Записывают интервал, в котором могут находиться с вероятностью =0,95 значения времени удерживания дезоксиниваленола (вомитоксина) от () до ().

По результатам хроматографирования градуировочных растворов определяют значение градуировочного коэффициента. Для этого сначала вычисляют для каждого градуировочного раствора значение градуировочного коэффициента , нг/мм или нг/е.о.п., по формуле

, (5)

где - масса дезоксиниваленола (вомитоксина), введенная в хроматограф с -ым градуировочным раствором, нг (по данным таблицы 1);

- высота пика -го градуировочного раствора, мм или е.о.п.

Среднеарифметическое значение градуировочного коэффициента, , нг/мм или нг/е.о.п., вычисляют по формуле

, (6)

где - количество градуировочных растворов, введенных в хроматограф (=9).

Значение градуировочного коэффициента контролируют не реже одного раза в месяц. Для этого вводят в хроматограф один из градуировочных растворов и вычисляют для него градуировочный коэффициент . Если при этом , прибор не подлежит переградуировке. В противном случае прибор должен быть отградуирован заново согласно 4.8.

5 Проведение испытания

5.1 Экстракция дезоксиниваленола (вомитоксина) из исследуемого продукта

Навеску исследуемого продукта массой (25±0,05) г помещают в колбу с притертой пробкой вместимостью 500 см, приливают 20 см бидистиллированной воды и затем 105 см ацетонитрила. Колбу закрывают пробкой и встряхивают на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный складчатый фильтр в колбу с притертой пробкой.

5.2 Очистка экстракта

5 см фильтрата (5.1) переносят в колонку 1 (ЖХ) (4.6) и элюируют в остродонную колбу вместимостью 50 см со скоростью не более 0,5 см/мин. С целью ускорения элюирование можно проводить с помощью вакуума водоструйного насоса. Не допуская осушения сорбента, через колонку пропускают 15 см ацетонитрила, собирая элюат в ту же остродонную колбу.

По окончании элюирования из колбы с помощью ротационного вакуумного испарителя при температуре не более 60 °С полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку добавляют 1 см бидистиллированной воды. Колбу закрывают пробкой и ее стенки осторожно споласкивают находящейся в ней жидкостью. Содержимое колбы с помощью пипетки переносят в колонку 2 (4.6). Стенки колбы повторно обмывают 1 см бидистиллированной воды, которую также переносят в колонку 2. Колонку 2 промывают 2 см бидистиллированной воды и элюат отбрасывают.

Из колонки 2 дезоксиниваленол элюируют 7,5 см ацетонитрила в остродонную колбу вместимостью 25 см. Собранный элюат упаривают досуха с помощью ротационного вакуумного испарителя. Остаток растворяют в 0,2 см метилового спирта. Полученный раствор используют для хроматографического анализа (далее - испытуемый раство

р).

5.3 Выполнение измерений

5.3.1 Условия проведения измерений

Измерения проводят в следующих условиях:

а) разделение компонентов проводят на колонке размером 80х2 мм;

б) сорбент - диабонд С 16 с эффективностью не менее 5000 т. т.;

в) рабочие длины волн УФ-детектора - 230 и 276 нм (230 нм - опорная длина волны, 276 нм - длина волны для контроля чистоты экстракта);

г) скорость элюирования - 100 мкдм/мин.

Элюирование проводят в градиентном режиме. Для этого в шприце насоса готовят элюент с перформированным градиентом. Насос устанавливают в перевернутое положение и набирают последовательно:

600 мкдм воды;

500 мкдм раствора ацетонитрил-вода (0,05:1);

600 мкдм раствора ацетонитрил-вода (0,125:1);

100 мкдм раствора ацетонитрил-вода (0,5:1);

100 мкдм раствора ацетонитрил-вода (1:1);

700 мкдм ацетонитрила;

д) объем анализируемого раствора - 4 мкдм;

е) чувствительность - 0,1 е.о.п. при 100 милливольтах шкалы самописца.

На приборе устанавливают следующие параметры:

количество образцов - 3;

объем ступеней, мкдм: 1-600, 2-500, 3-600, 4-100, 5-100, 6-700;

объем регенерации, мкдм - 200, буфера - 15, пробы - 4, буфера - 10;

расход элюента - 100 мкдм/мин; скорость набора - 800 мкдм

/мин.

5.3.2 Проведение измерений испытуемого раствора

Допускается проведение анализа методом внешнего стандарта.

Если прибор предварительно отградуирован по 4.8, в колонку хроматографа вводят три раза по 4 мкдм испытуемого раствора, полученного по 5.2. По показаниям прибора при двух длинах волны - 230 и 276 нм оценивают чистоту испытуемого раствора согласно инструкции к прибору. Идентификацию пика дезоксиниваленола (вомитоксина) проводят по времени удерживания (), которое должно находиться в интервале, установленном при градуировке: . Измеряют высоту пиков дезоксиниваленола (вомитоксина).

Если прибор предварительно не градуировали, в колонку хроматографа вводят три раза по 4 мкдм испытуемого раствора и градуировочных растворов. Измеряют высоту пиков дезоксиниваленола (вомитоксина) испытуемого раствора и того градуировочного раствора, высота пиков которого наименее отличается от высоты пиков испытуемого раствора.

6 Обработка результатов

6.1 В том случае, когда одновременно с испытуемыми растворами хроматографируют и градуировочные растворы, массовую долю дезоксиниваленола (вомитоксина) , нг/г, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

, (7)

где - масса дезоксиниваленола (вомитоксина), введенная в хроматограф с -ым градуировочным раствором, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора, нг (определяется по данным таблицы 1);

- среднее арифметическое значение трех измерений высоты пиков испытуемого раствора, мм или е. о. п.;

- среднее арифметическое значение трех измерений высоты пиков -го градуировочного раствора, мм или е. о. п.;

0,2 - объем испытуемого раствора дезоксиниваленола (вомитоксина) из образца, см;

4 - объем испытуемого раствора, введенный в хроматограф, мкдм;

125 - объем экстракта испытуемой пробы, см;

5 - объем экстракта испытуемой пробы, взятый для очистки, см;

25 - масса навески испытуемой пробы, г;

87 - степень извлечения дезоксиниваленола (вомитоксина) из пробы, %;

1000 - коэффициент пересчета см в м

кдм.

6.2 Массовую долю дезоксиниваленола (вомитоксина) , нг/г, в испытуемой пробе с использованием градуировочного коэффициента вычисляют по формуле

, (8)

где - градуировочный коэффициент, нг/мм или нг/е.о.п.

6.3 При анализе каждой испытуемой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы по 5.1.

Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает , где , и - результаты первого и второго параллельных определений и их среднеарифметическое значение, соответственно, то среднеарифметическое значение принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива () приведено в таблице 2.

По полученному результату анализа и значению относительной погрешности (, таблица 2) рассчитывают абсолютную погрешность , нг/г, по формуле

. (9)

Таблица 2 - Значение нормативов внутреннего оперативного контроля (ВОК) и характеристики погрешности анализа (для вероятности =0,95)

		Значение норматива ВОК, %
Диапазон массовой концентрации дезоксиниваленола (вомитоксина), нг/г	Границы относительной погрешности ±	сходимости (), =2	воспроизводимости () =2	точности ()
0,2-2,0	25	24	36	36
св. 2,0-4,0	21	20	30	30

Результат анализа представляют в виде: () нг/г при =0,95. Числовое значение результата анализа и его погрешность должны оканчиваться цифрой одного и того же разряда.

7 Контроль точности анализов

Внутренний оперативный контроль (ВОК) точности анализов включает контроль сходимости, воспроизводимости и точности результатов анализов. При превышении нормативов ВОК точности проводят повторные анализы. При повторном превышении указанных нормативов анализы приостанавливают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

7.1 Сходимость параллельных определений контролируют для каждой анализируемой пробы согласно 6.3.

7.2 Для проведения ВОК воспроизводимости используют рабочие пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, получая два результата анализа в разных лабораториях или в одной, причем в этом случае максимально варьируют условия проведения анализа, т. е. используют разные наборы мерной посуды, анализы выполняют в разные дни или два различных аналитика.

Воспроизводимость контрольных анализов, а также воспроизводимость результатов анализа рабочих проб, выполненных за период, в течение которого условия проведения анализа принимают за стабильные и соответствующие условиям проведения контрольных анализов, признают удовлетворительной, если , где , и - результаты анализа одной и той же пробы, полученные при варьирующих условиях в одной лаборатории или разных лабораториях, и их среднеарифметическое значение, соответственно; - значение норматива ВОК воспроизводимости (таблица 2).

Периодичность проведения ВОК воспроизводимости не реже одного раза в две недели.

7.3 Для проведения ВОК точности используют рабочие пробы с известной добавкой дезоксиниваленола (вомитоксина). Пробу делят на две равные части, первую из которых анализируют в соответствии с методикой, а во вторую вводят известную добавку дезоксиниваленола (вомитоксина), а затем анализируют в соответствии с методикой. Добавка должна составлять 50-150% содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) в анализируемой пробе. Результаты получают по возможности в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Точность контрольных анализов признают удовлетворительной, если , где , и - результаты контрольных анализов пробы с известной добавкой, без добавки и значение добавки, соответственно; - значение норматива ВОК точности при использовании метода добавок (таблица 2).

Контроль точности анализа проводят не реже одного раза в месяц, а также при смене реактивов и после длительного перерыва в работе.

7.4 Результаты ВОК заносят в специальный журнал контроля.

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное). Библиография

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)

[1] ТУ 6-16-3096-89 Уголь активированный

[2] ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)