ГОСТ 9.052-88
Группа Т99
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
Единая система защиты от коррозии и старения
МАСЛА И СМАЗКИ
Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов
Unified system of corrosion and ageing protection.
Oils and greases. Laboratory test methods for mould resistance
МКС 19.040
75.100
ОКСТУ 0009
Дата введения 1989-01-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством высшего и среднего специального образования СССР
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 25.03.88 N 754
3. ВЗАМЕН ГОСТ 9.052-75
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка | Номер пункта, подпункта, приложения |
ГОСТ 9.048-89 | 1.3.3, 1.4, 1.5.1, 1.5.2, 1.5.3, 1.6.1, 2.4, 2.6.1, 3.4, 3.6.1, 4.4, приложение |
ГОСТ 61-75 | Приложение |
ГОСТ 1770-74 | Приложение |
ГОСТ 2517-85 | 1.2.1 |
ГОСТ 4523-77 | Приложение |
ГОСТ 6709-72 | Приложение |
ГОСТ 10652-73 | Приложение |
ГОСТ 16317-87 | Приложение |
ГОСТ 25336-82 | Приложение |
ГОСТ 29329-92 | Приложение |
5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 3-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 5-6-93)
6. ПЕРЕИЗДАНИЕ
Настоящий стандарт распространяется на масла и смазки и устанавливает методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов:
1 - для установления грибостойкости масел и смазок при отсутствии минеральных и органических загрязнений;
2 - для установления грибостойкости смазок в условиях, имитирующих минеральные загрязнения;
3 - для установления грибостойкости масел в условиях, имитирующих минеральные загрязнения;
4 - для установления грибостойкости масел и смазок в условиях, имитирующих минеральные и органические загрязнения.
Смазки, применяемые для оптических приборов, испытывают только методом 1.
Методы применяют при испытании масел и смазок, к которым в стандартах или технических условиях предъявляют требования грибостойкости.
1. МЕТОД 1
1. МЕТОД 1
1.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных водной суспензией спор грибов, в условиях, оптимальных для развития грибов, без дополнительного источника минерального и органического питания.
1.2. Отбор образцов
1.2.1. Масла и смазки отбирают по ГОСТ 2517 массой 10-15 г.
1.2.2. Образцами являются масла и смазки в состоянии поставки, без специальной очистки и стерилизации.
1.2.3. Количество параллельных образцов должно быть не менее пяти.
1.3. Виды грибов
1.3.1. Для испытаний применяют чистые культуры следующих видов плесневых грибов:
Aspergillus niger van Tieghem
Penicillium chrysogenum Thom
Penicillium cyclopium Westling
Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) Bainier
Paecilomyces varioti Bainier
1.3.2. Культуры грибов получают в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, поддерживают периодическим пересевом и выращивают непосредственно перед испытаниями.
1.3.3. Пересев, выращивание и хранение культур грибов - по ГОСТ 9.048.
1.4. Аппаратура, материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048.
1.5. Подготовка к испытаниям
1.5.1. Посуду и материалы готовят по ГОСТ 9.048.
1.5.2. Среды для выращивания, хранения культур грибов и для испытаний готовят по ГОСТ 9.048.
Рецептура сред приведена в таблице.
Наименование реактива | Среда 1 (Чапека-Докса с агаром) | Среда 2 (Чапека-Докса | Среда 3 (выщело- | Среда 4 (сусло-агар) | Среда 5 (минеральная без сахарозы) |
Однозамещенный фосфорнокислый калий, г | 0,7 | 0,7 | - | - | 1,0 |
Двузамещенный фосфорнокислый калий, г | 0,3 | 0,3 | - | - | - |
Сернокислый магний, г | 0,5 | 0,5 | - | - | 0,5 |
Азотнокислый натрий, г | 2,0 | 2,0 | - | - | 3,0 |
Хлористый калий, г | 0,5 | 0,5 | - | - | 2,0 |
Сернокислое железо, г | 0,01 | 0,01 | - | - | - |
Сахароза, г | 30,0 | - | - | - | - |
Агар-агар, г | 30,0 | Выщело- | Выщело- | 30,0 | - |
Четырехбаллинговое неохмеленное пивное сусло | - | - | - | До 1000 | - |
Дистиллированная вода, см | До 1000 | - | - | ||
Водопроводная вода, см | - | - | - | - | До 1000 |
1.5.3. Чистые культуры грибов пересевают и выращивают по ГОСТ 9.048, используя грибы, приведенные в п.1.3.1.
1.5.4. Для размещения образцов масел в чашку Петри наливают 20-30 см
среды 3 и дают ей застыть. В застывшей среде просверливают пять лунок глубиной около 5 мм с помощью стерильного сверла диаметром 10 мм и наливают образцы масел на 1 мм ниже уровня среды.
Образцы смазок наносят на предметные стекла, покрывая всю поверхность слоем 1,5-2,0 мм, и помещают в чашки Петри.
1.5.5. Контроль жизнеспособности спор грибов проводят по ГОСТ 9.048.
Для контроля жизнеспособности спор грибов в чашку Петри наливают среду 1 или 4 в количестве 20-30 см и дают ей застыть.
1.6. Проведение испытаний
1.6.1. Водную суспензию спор грибов готовят по ГОСТ 9.048, используя грибы, выращенные, как указано в п.1.5.3.
1.6.2. Предметные стекла в чашках Петри, чашки Петри с образцами масел помещают в бокс. Поверхность образцов заражают водной суспензией спор грибов с помощью пульверизатора, не допуская слияния капель.
1.6.3. Образцы масел и смазок после заражения выдерживают 1-2 ч при температуре (25±10) °С.
1.6.4. Предметные стекла в чашках Петри и чашки Петри с зараженными образцами и средами помещают в эксикатор, на дно которого налита вода. Эксикатор устанавливают в термостат с температурой (29±2) °С.
1.6.5. Образцы выдерживают в термостате 56 сут.
1.6.6. Через 3-7 сут после начала испытаний осматривают контрольную чашку Петри. Если на поверхности среды развитие грибов не наблюдается, споры грибов считают нежизнеспособными. Испытания прекращают и повторяют их на новых образцах с вновь приготовленной суспензией спор из новой партии грибов.
1.6.7. Через 28 сут производят промежуточный осмотр образцов. Испытания образцов, на которых обнаруживают развитие грибов, прекращают.
1.6.8. По окончании испытаний предметные стекла в чашках Петри и чашки Петри извлекают из эксикатора и осматривают образцы.
1.7. Обработка результатов
1.7.1. Образцы смазок и масел осматривают под микроскопом при 50-60-кратном увеличении.
1.7.2. Масла и смазки считают грибостойкими при отсутствии развития грибов на всех испытанных образцах.
2. МЕТОД 2
2.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального питания.
2.2. Отбор образцов - по п.1.2.
2.3. Виды грибов - по п.1.3.
2.4. Аппаратура, материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048.
2.5. Подготовка к испытаниям - по пп.1.5.1-1.5.3, 1.5.5.
2.5.1. Для размещения образцов смазок среду 2 наливают в чашку Петри в количестве 20-30 см и дают ей застыть.
2.6. Проведение испытаний
2.6.1. Суспензию спор грибов в среде 5 готовят по ГОСТ 9.048.
2.6.2. Смазки наносят скальпелем в количестве пяти образцов размером 10х10 мм толщиной 1,5-2,0 мм на поверхность среды в чашку Петри, подготовленную, как указано в п.2.5.1.
2.6.3. Дальнейший порядок проведения испытаний соответствует требованиям пп.1.6.2-1.6.4.
2.6.4. Образцы выдерживают в течение 28 сут.
2.6.5. Дальнейший порядок проведения испытаний - по пп.1.6.6-1.6.8 с промежуточным осмотром образцов через 14 сут.
2.7. Обработка результатов - по пп.1.7.1, 1.7.2.
3. МЕТОД 3
3.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального питания.
3.2. Отбор образцов - по п.1.2.
3.3. Виды грибов - по п.1.3.
3.4. Аппаратура, материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048.
3.5. Подготовка к испытаниям - по пп.1.5.1-1.5.3 и 1.5.5.
3.5.1. Для размещения образцов масел готовят пробирки с 2-3 смсуспензии спор грибов в среде 5.
3.5.2. Контролем служит суспензия спор грибов в среде 5.
3.6. Проведение испытаний
3.6.1. Суспензию спор грибов в среде 5 готовят по ГОСТ 9.048.
3.6.2. Образцы масел в количестве 2 см вносят не менее чем в пять пробирок, приготовленных, как указано в п.3.5.1.
3.6.3. Пробирки помещают в наклонном положении под углом 30° и выдерживают в термостате при температуре (29±2) °С.
3.6.4. Пробирки с образцами выдерживают в термостате 10 сут.
3.6.5. Через 5 и 7 сут осматривают образцы. Допускается отбирать пробы минеральной среды из пробирок для оценки грибостойкости биолюминесцентным методом, при этом пробирки с образцами выдерживают в термостате 3 и 5 сут.
При появлении признаков развития грибов в образцах испытания прекращают.
3.6.6. По окончании испытаний пробирки с образцами извлекают из термостата и осматривают невооруженным глазом или с помощью лупы при 2,5-5,0-кратном увеличении.
3.7. Обработка результатов
3.7.1. Масла считаются грибостойкими, если отсутствует развитие грибов на всех испытанных образцах (отсутствует пленка на границе раздела среда-масло, в пробирках среда прозрачна и не пигментирована, нет осадка).
3.7.2. Масла считаются не стойкими к плесневым грибам, если на образцах наблюдается развитие грибов, признаком которого служит образование пленки на границе раздела среда-масло, помутнение и пигментация среды, образование осадка.
3.7.3. Допускается оценивать грибостойкость масел биолюминесцентным методом, приведенным в приложении.
4. МЕТОД 4
4.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального и органического питания.
4.2. Отбор образцов - по п.1.2.
4.3. Виды грибов - по п.1.3.
4.4. Аппаратура, материалы и реактивы - по ГОСТ 9.048.
4.5. Подготовка к испытаниям - по пп.1.5.1-1.5.3, 1.5.5.
4.5.1. Для размещения образцов смазок готовят чашки Петри, как указано в п.2.5.1, используя среду 1 или 4.
4.5.2. Для размещения образцов масел готовят лунки, как указано в п.1.5.4, используя среду 1 или 4.
4.6. Проведение испытаний - по п.2.6.
4.6.1. Образцы выдерживают в термостате в условиях, приведенных в п.1.6.4, 14 сут.
4.6.2. Промежуточный осмотр образцов производят через 7 сут после начала испытаний.
4.7. Обработка результатов - по пп.1.7.1 и 1.7.2.
5. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ (обязательное). БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ГРИБОСТОЙКОСТИ
ПРИЛОЖЕНИЕ
Обязательное
Сущность метода заключается в определении количества внутриклеточной аденозин-5'-трифосфорной кислоты динатриевой соли (АТФ) в минеральной среде после испытания масел на грибостойкость (п.3.6.5) с помощью специфической ферментативной хемилюминесцентной реакции с использованием люциферин-люциферазной системы светляков. Интенсивность излучаемого свечения прямо пропорциональна концентрации АТФ. Концентрация АТФ пропорциональна количеству живых клеток, так как ее содержание во всех типах живых клеток примерно одинаково и составляет 1-10 мг/г сухого веса. Этот факт является основной биолюминесцентного метода определения биомассы.
1. Аппаратура, материалы и реактивы
Хемилюминометр медицинский ДЛИ 31.560.000, предназначенный для измерения интенсивности сверхслабого свечения в области спектра 400-600 нм. Допускается использовать другие приборы аналогичного назначения, обеспечивающие измерение световых потоков от 10
до 10
квант/с.
Весы для статического взвешивания по ГОСТ 29329.
Термостат, обеспечивающий температуру нагрева до 200 °С.
Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 16317.
Дозатор для отбора проб 0,1 см.
Лабораторный рН-метр.
Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336.
Колбы цилиндрические мензурные вместимостью 25 см по ГОСТ 1770.
Пипетки вместимостью 1, 10 см.
Аденозин-5'-трифосфорной кислоты динатриевая соль, 3-водная (АТФ).
Люцифераза светляков.
Люциферин.
Диметилсульфоксид (ДМСО), х.ч.
Трис-(оксиметил)-аминометан, х.ч.
Кислота уксусная, х.ч. по ГОСТ 61.
Магний сернокислый, 7-водный, х.ч. по ГОСТ 4523.
Соль динатриевая этилендиамин - N, N, N', N' - тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б) (ЭДТА) по ГОСТ 10652.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
2. Подготовка к испытаниям
2.1. Стерилизуют посуду по ГОСТ 9.048.
2.2. Готовят раствор АТФ 1 ммоль/дм: 13,8 мг АТФ помещают в мерную колбу вместимостью 25 см, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Раствор АТФ 1 ммоль/дм разливают на порции объемом 1 см и хранят при температуре минус 20 °С. В замороженном виде раствор АТФ допускается хранить не более 3 месяцев.
2.3. Готовят стандартный раствор АТФ 10 мкмоль/дм: порцию раствора АТФ 1 ммоль/дм (по п.2.2) размораживают, отбирают с помощью дозатора 0,1 см раствора и помещают его в пробирку, содержащую 10 см дистиллированной воды. Раствор АТФ 10 мкмоль/дм готовят непосредственно перед применением.
2.4. Готовят 20%-ный раствор уксусной кислоты: 10 см уксусной кислоты разбавляют 40 см дистиллированной воды.
2.5. Готовят 0,1 моль/дм трис-ацетатный буферный раствор с рН-7,6, содержащий 10 ммоль/дм сернокислого магния, 2 ммоль/дм ЭДТА: в мерную колбу вместимостью 50 см загружают 0,605 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,123 г сернокислого магния, 0,036 г ЭДТА, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Затем все содержимое колбы переносят в стакан вместимостью 100 см и титруют 20%-ным раствором уксусной кислоты до рН-7,8.
2.6. Готовят раствор люциферазы: 10 мг люциферазы растворяют в 10 см 0,1 моль/дм трис-ацетатном буферном растворе (п.2.5). Приготовленный раствор люциферазы хранят во льду.
2.7. Готовят раствор люциферина: 3 мг люциферина растворяют в 10 см 0,1 моль/дм трис-ацетатного буферного раствора (п.2.5).
2.8. Готовят экстракт клеток: отбирают из пробирок с образцами после выдержки их в термостате 3 и 5 сут (п.3.6.5) пробу минеральной среды объемом 0,1 см и добавляют ее в пробирку к 0,9 см диметилсульфоксида (ДМСО). Смесь перемешивают встряхиванием в течение 1-2 мин. Экстракт пригоден для анализа в течение 1 сут.
3. Проведение испытаний
3.1. Помещают в кювету люминометра с помощью дозатора последовательно 0,1 см раствора люциферина, 0,1 см раствора люциферазы, 0,7 см трис-ацетатного буферного раствора и регистрируют интенсивность фонового свечения 
в милливольтах.
3.2. Добавляют в ту же кювету дозатором 0,1 см экстракта клеток (п.2.8), перемешивают и регистрируют сигнал интенсивности люминесценции 
.
3.3. Добавляют в ту же кювету 0,02 см стандартного раствора АТФ (п.2.3) и регистрируют сигнал интенсивности люминесценции 
.
4. Обработка результатов
4.1. Интенсивность люминесценции образца (
) в милливольтах вычисляют по формуле
. (1)
4.2. Интенсивность люминесценции стандартного раствора АТФ (
) в милливольтах вычисляют по формуле
. (2)
4.3. Концентрацию АТФ 
в микромолях в образце вычисляют по формуле
, (3)
где 
- объем экстракта клеток, равный 0,1 см;
- объем реакционной смеси до добавления стандартного раствора АТФ, равный 1 см;
- объем реакционной смеси после добавления стандартного раствора АТФ, равный 1,02 см;
- объем добавленного стандартного раствора АТФ, равный 0,02 см;
- концентрация АТФ в стандартном растворе, равная 10 мкмоль;
10 - коэффициент, учитывающий разбавление пробы образца при экстракции клеток диметилсульфоксидом в 10 раз.
При упрощении формула (3) приобретает вид:
.
4.4. Масла являются грибостойкими, если концентрация АТФ меньше или равна 10
моль, масла не грибостойки, если концентрация АТФ в образцах больше 10 моль.