ГОСТ 26573.1-93
Группа С19
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
ПРЕМИКСЫ
Методы определения витамина А
Premixes. Methods for determination of vitamin A
МКС 65.120
ОКСТУ 9209
Дата введения 1995-01-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Госстандартом России
ВНЕСЕН Техническим секретариатом Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации
2 ПРИНЯТ Межгосударственным Советом по стандартизации, метрологии и сертификации 21 октября 1993 года
За принятие проголосовали:
Наименование государства | Наименование национального органа |
Киргизская Республика | Киргизстандарт |
Республика Молдова | Молдовастандарт |
Российская Федерация | Госстандарт России |
Республика Таджикистан | Таджикгосстандарт |
Туркменистан | Главная государственная инспекция Туркменистана |
Украина | Госстандарт Украины |
3 Постановлением Комитета Российской Федерации по стандартизации, метрологии и сертификации от 2 июня 1994 года N 160 межгосударственный стандарт ГОСТ 26573.1-93 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта Российской Федерации с 1 января 1995 года
4 ВЗАМЕН ГОСТ 26573.1-85
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка | Номер раздела, пункта |
ГОСТ 427-75 | 3.1 |
ГОСТ 1770-74 | 2.1; 3.1; 4.1 |
ГОСТ 3118-77 | 4.1 |
ГОСТ 4166-76 | 3.1; 4.1 |
ГОСТ 4204-77 | 4.1 |
ГОСТ 4232-74 | 4.1 |
ГОСТ 4328-77 | 4.1 |
ГОСТ 5815-77 | 4.1 |
ГОСТ 5962-67 | 3.1; 4.1 |
ГОСТ 6217-74 | 4.1 |
ГОСТ 6709-72 | 2.1; 3.1; 4.1 |
ГОСТ 8677-76 | 4.1 |
ГОСТ 9412-93 | 3.1 |
ГОСТ 13496.0-80 | 2 |
ГОСТ 15150-69 | 4.1 |
ГОСТ 18300-87 | 2.1; 4.1 |
ГОСТ 20015-88 | 4.1 |
ГОСТ 20490-75 | 4.1 |
ГОСТ 24104-88 | 2.1; 3.1; 4.1 |
ГОСТ 24363-80 | 3.1; 4.1 |
ГОСТ 25336-82 | 2.1; 3.1; 4.1 |
ТУ 2.833.104-85 | 3.1 |
ТУ 6-09-402-87 | 2.1; 3.1 |
ТУ 6-09-1182-76 | 3.1 |
ТУ 6-09-1678-86 | 3.1 |
ТУ 6-09-3375-78 | 3.1 |
ТУ 6-09-3916-85 | 3.1 |
ТУ 6-09-5319-86 | 3.1; 4.1 |
ТУ 6-09-06-1092-83 | 2.1 |
ТУ 25-05.2830-83 | 2.1 |
ТУ 84-11-99-89 | 2.1; 4.1 |
МРТУ 6-09-6628-70 | 2.1 |
Настоящий стандарт устанавливает методы определения витамина А в премиксах, предназначенных для обогащения комбикормов, белково-витаминных добавок и кормовых смесей.
1 Отбор проб
1 Отбор проб
Отбор проб - по ГОСТ 13496.0.
2 Определение витамина А методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии
Сущность метода заключается в экстракции витамина А (ретинола ацетат) из премикса экстрагентом и хроматографическом анализе содержания витамина в испытуемом растворе с использованием жидкостного хроматографа.
Метод применим в диапазоне концентраций витамина А 20-10000 международных единиц (ME) на 1 г премикса. Предельная погрешность метода - 10%.
2.1. Аппаратура и реактивы
Хроматограф жидкостный микроколоночный "Милихром" по ТУ 25-05.2830 или его последующие модификации со спектрофотометрическим детектором и спектральным диапазоном 190-360 нм.
Колонка хроматографическая одного из указанных размеров: 2х64, 2х80, 2х120 мм с числом теоретических тарелок не менее 4000 (по прилагаемому к колонке паспорту), заполненная одним из следующих сорбентов: Силасорб С
, Силасорб SPHС, Сепарон С.
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*.
__________________
* С 1 июля 2002 года вводится в действие ГОСТ 24104-2001 (здесь и далее).
Баня водяная, обеспечивающая постоянство температуры (75±1) °С.
Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы 186-1100 нм.
Колбы конические со шлифом вместимостью 25 см
, КН-2-25-18 МХС по ГОСТ 25336.
Пипетка 4-1(2)-1 (исполнения 4, 1-го или 2-го класса, вместимостью 1 см).
Пипетка 6-1(2)-10 или 7-1(2)-10.
Пипетка 2(3)-1(2)-50.
Колбы мерные 2-25-1(2) (исполнения 2, вместимостью 25 см, 1-го или 2-го класса точности) по ГОСТ 1770.
Колбы мерные 2-50-1(2) по ГОСТ 1770.
Цилиндры 1(2, 3, 4)-100, 1(2, 3, 4)-500 по ГОСТ 1770.
Воронка ВФО-40-ПОР 16 ХС по ГОСТ 25336.
Холодильник ХПТ-1-100-18 ХС по ГОСТ 25336.
Насос водоструйный по ГОСТ 25336.
Бюретка 6-2-2 (исполнения 6, 2-го класса точности, вместимостью 2 см).
Склянки с притертой пробкой.
Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300.
Спирт этиловый абсолютированный по ТУ 84-11-99.
Спирт изопропиловый (пропанол-2), х. ч., по ТУ 6-09-402.
Спирт пропиловый (пропанол-1), х. ч., по МРТУ 6-09-6628.
Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, х. ч., по ТУ 6-09-06-1092.
Ретинола ацетат в масле, 3,44%-ный раствор с активностью 90000-110000 МЕ/см по фармакопее.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Примечание. При проведении испытаний допускается использовать импортные аппаратуру, материалы и реактивы с характеристиками не ниже отечественных аналогов.
2.2 Подготовка к испытанию
2.2.1 Приготовление элюента для хроматографии
Трехкомпонентный элюент готовят смешиванием пропилового спирта, дистиллированной воды и ацетонитрила в соотношении 50:8:42 (% об.). Для этого в склянку вместимостью 1000 см вносят цилиндром 500 см пропилового спирта, 420 см ацетонитрила и 80 см дистиллированной воды.
Приготовленную смесь растворителей фильтруют через стеклянный фильтр для удаления возможных механических примесей и пузырьков воздуха и помещают в стеклянный сосуд с притертой пробкой. Полученный раствор можно хранить в течение 1 мес.
2.2.2 Подготовка хроматографической колонки
При работе на не использованной ранее колонке или колонке, которая не была подключена к прибору "Милихром", из нее следует удалить воздух и тщательно промыть элюентом до получения стабильной нулевой линии. Для этого через колонку пропускают элюент в количестве 20-30 свободных объемов колонки, т.е. два полных шприца насоса хроматографа при расходе элюента сначала 50 мкдм/мин, а затем 100 мкдм/мин. Промывку колонки заканчивают при получении стабильной нулевой линии.
После промывки колонки проводят ее насыщение витамином А. Для этого выполняют 7-10 анализов наиболее концентрированного градуировочного раствора витамина А. Насыщение колонки прекращают, когда отношение разности между двумя последовательными определениями концентрации витамина А к среднему арифметическому значению этих операций не превышает 3% отн.
При правильной эксплуатации колонка выдерживает до 500-600 анализов.
2.2.3 Приготовление растворителя для экстракции витамина А из премикса
Для экстракции, витамина А из премиксов используют двухкомпонентный экстрагент состава изопропиловый спирт и дистиллированная вода в соотношении 97:3 (% об.). Для этого в мерную колбу вместимостью 1000 см вносят пипеткой 30 см дистиллированной воды и доводят до метки изопропиловым спиртом. Хранят в стеклянной емкости с притертой пробкой.
2.2.4 Приготовление абсолютного этилового спирта
К этиловому ректификованному спирту прибавляют в соотношении 4:1 свежепрокаленную при температуре 800-1000 °С в течение 2 ч окись кальция. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2-3 ч. Затем смесь перегоняют, отбрасывая начальную и конечную порции отгона (по 20-30 см). Перегнанный абсолютный спирт при измерении на спектрофотометре относительно дистиллированной воды в кювете с толщиной слоя 1 см должен иметь значение оптической плотности, не превышающее 0,01 единиц в области 320-350 нм и 0,05 при 280-300 нм.
Если спирт не отвечает вышеуказанным требованиям, процесс обезвоживания повторяют.
Этиловый абсолютный спирт промышленного изготовления перегоняют над твердой гидроокисью натрия или калия (10 г щелочи на 1 дм спирта) и проверяют, как указано выше.
2.2.5 Определение активности витамина А в масляном препарате
0,1 г масляного препарата витамина А растворяют в абсолютном этиловом спирте в мерной колбе вместимостью 50 см, перемешивают. Отбирают 1 см раствора в колбу вместимостью 50 см, заполняют ее до метки абсолютным спиртом и измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм при длине волны 326 нм. В качестве контрольного раствора используется абсолютный спирт.
Активность витамина А (
) в международных единицах (ME) в 1 г препарата вычисляют по формуле
,
где 
- оптическая плотность раствора при длине волны 326 нм; 
, 
- первое и второе разведения, см;
1880 - коэффициент перевода в ME;
- масса навески масляного препарата, г;
- объем раствора, используемый для второго разведения, см;
100 - коэффициент
2.2.6 Построение градуировочного графика
Для приготовления стандартного раствора взвешивают навеску масляного препарата витамина А (3,44%-ный раствор), необходимую для получения раствора с активностью 30000 ME в 50 см или 600 МЕ/см. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 50 см, растворяют в изопропиловом спирте, перемешивают и доводят этим спиртом до метки.
Раствор хранят в холодильнике и используют в течение одной недели.
Из этого раствора готовят градуировочные (рабочие) растворы. Для премиксов, содержащих витамин А в количестве от 100 МЕ/г и выше, готовят рабочие растворы с содержанием 120, 300, 600, 1200, 3000, 6000, 12000 ME витамина в 25 см. Для этого берут соответственно, 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0; 20,0 см исходного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см и доводят до метки изопропиловым спиртом.
Для премиксов, содержащих витамин А в количестве 20-100 МЕ/г, готовят рабочие растворы с содержанием 20, 40, 60, 90, 120 ME в 25 см. Для этого берут соответственно 0,033; 0,066; 0,1; 0,15; 0,2 см исходного раствора, помещают в мерные колбы вместимостью 25 см при помощи микробюретки и доводят до метки изопропиловым спиртом.
Срок годности растворов - не более 1 мес при хранении в холодильнике при температуре 4-10 °С.
Полученные рабочие растворы анализируют на жидкостном хроматографе "Милихром" при следующих условиях:
хроматографическая колонка 2х64 мм (2х80 мм), (2х120 мм);
сорбент - Силасорб С; Силасорб SPHC; Сепарон С;
трехкомпонентный элюент на основе ацетонитрила;
объем пробы - 6 мкдм;
длина волны - 328 нм;
постоянная времени - 0,2 с;
скорость подачи элюента - 150 мкдм/мин.
Удерживаемый объем пика витамина А составляет 300-360 мкдм (может меняться в зависимости от длины колонки).
Каждый раствор хроматографируют три раза. После выхода пика колонку промывают, прокачивая через нее 100-200 мкдм элюента до выхода на нулевую линию.
Значение средних высот хроматографических пиков, выраженное в единицах оптической плотности (е.о.п.), откладывают по оси ординат градуировочного графика, а по оси абсцисс - значение активности витамина А в 25 см раствора. Для концентраций витамина А 120-10000 и 20-120 МЕ/г градуировочные графики строят отдельно.
Градуировочный график строят также, откладывая по оси ординат средние высоты хроматографических пиков (
), выраженные в единицах длины (мм) с учетом чувствительности прибора. В этом случае содержание витамина в пробе определяют, измеряя высоту соответствующего хроматографического пика линейкой.
Пример хроматограммы представлен на рисунке 1.
Черт.1. Хроматограмма раствора витамина А (ретинола ацетат) в изопропиловом спирте
Хроматограмма раствора витамина А
(ретинола ацетат) в изопропиловом спирте
Черт.1
Построение градуировочных графиков можно заменить расчетом коэффициентов наклона 
по формуле
,
где 
- коэффициент наклона градуировочного графика для градуировочного раствора, МЕ/е.о.п. или МЕ/мм;
- количество точек, по которым строится градуировочная кривая.
Значение коэффициента наклона вычисляют по формуле
,
где 
- содержание витамина А в соответствующем 
-м градуировочном растворе, ME;
- высота -го хроматографического пика, е.о.п. или мм.
2.2.7 Проверка градуировочного графика
Градуировочный график контролируют не реже одного раза в неделю. Для этого один-два рабочих раствора хроматографируют, как указано в 2.2.6.
Отклонение полученных результатов (высота пика, выраженная в е.о.п. или мм) от измеренных в момент построения градуировочного графика 
в процентах вычисляют по формуле
,
где 
и 
- высота хроматографического пика, определенная при построении градуировочного графика и в момент проверки соответственно, е.о.п. или мм.
Указанное отклонение не должно превышать 5%.
При отклонении более 5% строят новый градуировочный график свежеприготовленных растворов масляного препарата витамина А в изопропиловом спирте.
2.3 Экстракция витамина А из премиксов
На лабораторных аналитических весах взвешивают пробу премикса с погрешностью не более 0,0005 г. Навески премиксов и объемы растворов для экстракции приведены в таблице. Навеску премикса помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 25 см, куда приливают раствор для экстракции в соответствии с требованиями таблицы.
Содержание витамина А | Навеска премикса, г | Объем раствора для экстракции, |
20-100 | 10 | 15 |
100-2000 | 5 | 10 |
2000-10000 | 2 | 10 |
Колбы соединяют с обратным холодильником и нагревают на водяной бане при температуре (75±1) °С в течение 10 мин. Колбу с экстрактом премикса отсоединяют от обратного холодильника, закрывают притертой пробкой, охлаждают под струей воды до комнатной температуры и фильтруют через фильтр ПОР-16 размером пор 10-16 мкм с использованием водоструйного вакуумного насоса. Фильтрат собирают в мерную колбу вместимостью 25 см. Коническую колбу, в которой содержался экстракт премикса, два-три раза ополаскивают порциями изопропилового спирта на 2-3 см для количественного перенесения премикса на фильтр. При этом промывается и осадок на фильтре. Раствор в мерной колбе доводят до метки изопропиловым спиртом, тщательно перемешивают и хроматографируют.
2.4 Хроматографирование
Полученные экстракты хроматографируют, как описано в 2.2.6. Примеры хроматограмм экстрактов витамина А из премиксов представлены на рисунке 2.
Черт.2. Хроматограммы экстрактов витамина А (ретинола ацетат) из премиксов
Хроматограммы экстрактов витамина А
(ретинола ацетат) из премиксов
Черт.2
При возникновении сомнений в правильности выбора пика (по объему или времени удержания), соответствующего витамину А, необходимо в анализируемый экстракт внести небольшое количество одного из градуировочных растворов витамина А (соотношение экстракт : раствор витамина А=10:2). Увеличение высоты соответствующего пика по сравнению с высотой этого пика на хроматограмме, полученной до введения градуировочного раствора в анализируемый экстракт, свидетельствует, что этот пик соответствует витамину А.
2.5 Обработка результатов
Для определения содержания витамина А в премиксе проводят две экстракции и каждый экстракт хроматографируют три раза. Находят среднеарифметическое значение высоты пиков, выраженное либо в е.о.п., либо в миллиметрах, и по градуировочному графику определяют содержание витамина А в международных единицах.
Содержание витамина А в премиксах 
, МЕ/г, вычисляют по формуле
,
где 
- содержание витамина А, найденное по градуировочному графику, ME; - масса навески премикса, г.
Содержание витамина А в премиксах при использовании коэффициента вычисляют по формуле
.
Полученное числовое значение содержания витамина А округляют до целых чисел.
За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 10% относительно среднеарифметического значения, а между результатами, полученными в разных условиях, - 15%.
3. Определение витамина А методом нормальной фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии
Сущность метода заключается в омылении образца премикса спиртовым раствором гидроокиси калия, экстракции витамина А гексаном с последующим определением витамина методом нормальной высокоэффективной жидкостной хроматографии (НФВЭЖХ). Диапазон измерений 10-10000 МЕ/г. Предельная погрешность метода - 10%.
3.1 Аппаратура, реактивы и материалы
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Хроматограф жидкостный с фотометрическим детектором и систематической погрешностью измерений не выше 10% отн.: Хром 900 (ЧССР), Цвет 304 или 3006, Ликвохром (Венгрия).
Колонка хроматографическая стеклянная или металлическая высотой 150 мм и диаметром 3 мм.
Линейка измерительная металлическая по ГОСТ 427.
Скальпель.
Секундомер механический.
Испаритель ротационный ИР-1М вместимостью 2 дм или его аналоги.
Баня водяная, обеспечивающая нагрев до 80-100 °С.
Холодильники стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336.
Сорбент "Сепарон-SGX" зернением 7 мкм (ЧССР).
Колбы конические со шлифом вместимостью 250 см по ГОСТ 25336.
Воронки делительные вместимостью 100, 500 см по ГОСТ 25336.
Пипетки 1(2, 4, 5)-1(2)-1; 2(4, 5)-1(2)-2; 6(7)-1(2)-5; 6(7)-1(2)-10.
Микрошприцы МШ-50М по ТУ 2.833.104.
Колбы мерные 2-25-1(2); 2-100-1(2); 2-500-1(2) по ГОСТ 1770.
Цилиндры 1(2)-10; 1(2, 3, 4)-50; 1(2, 3, 4)-100; 1(2, 3, 4)-250; 1(2, 3, 4)-1000 по ГОСТ 1770.
Пробирки с притертой пробкой 2-10-0,1 по ГОСТ 1770.
Воронки стеклянные диаметром 4-6 см по ГОСТ 25336.
Колонки стеклянные диаметром 2-4 см и высотой 80 см для очистки растворителей.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962*.
________________
* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000 (здесь и далее).
Гексан по ТУ 6-09-3375, ч.
Спирт изопропиловый по ТУ 6-09-402.
Пирогаллол А по ТУ 6-09-5319.
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.
Алюминия окись, нейтральная по ТУ 6-09-3916.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Ретинола ацетат в масле, 3,44%-ный раствор с активностью 90000-110000 МЕ/см по фармакопее.
Бумага универсальная индикаторная по ТУ 6-09-1182.
Фильтры бумажные обеззоленные (красная лента) по ТУ 6-09-1678.
Марля медицинская по ГОСТ 9412.
Примечание - При проведении испытаний допускается использовать импортные аппаратуру, материалы и реактивы с характеристиками не ниже отечественных аналогов.
3.2 Подготовка к испытанию
3.2.1 Определение активности витамина А в масляном препарате - по 2.2.5.
3.2.2 Приготовление стандартного раствора витамина А
Для приготовления стандартного раствора взвешивают навеску масляного препарата витамина А (3,44%-ный раствор), необходимую для получения 25 см раствора с активностью 10000 ME. Навеску помещают в мерную колбу вместимостью 25 см, растворяют в изопропиловом спирте, перемешивают и доводят этим спиртом до метки.
Хранят в холодильнике и используют в течение недели.
3.2.3 Подготовка растворителей
Очистку растворителей, применяемых в хроматографии, проводят посредством перегонки, отбрасывая первую и последнюю фракции в количестве 1/10 от первоначального объема, или пропусканием через колонку, заполненную активированной окисью алюминия. Окись алюминия активируют при нагревании в течение 1 ч при температуре 400-450 °С. Колонку высотой 60-80 см и диаметром 2-4 см заполняют 80 г активированной окиси алюминия и пропускают через нее 700 см растворителя. Для проверки чистоты в колонку жидкостного хроматографа загружают 50 мкл растворителя. В случае его загрязнения на хроматограмме появляются пики, соответствующие времени удерживания витамина А.
3.2.4 Приготовление спиртового раствора гидроокиси калия с массовой долей 10%
Растворяют 20 г гидроокиси калия в 180 см этилового спирта. Раствор готовят непосредственно перед испытанием.
3.2.5 Подготовка жидкостного хроматографа к работе
Подготовка хроматографа и колонки к работе проводится согласно описанию, данному в инструкции к прибору. Элюент представляет собой смесь гексана с этанолом в объемном соотношении 99,5:0,5. Применяют стеклянную колонку высотой 150 мм и диаметром 3 мм, заполненную сорбентом "Сепарон-SGX" с зернением 7 мкм. Скорость элюирования 1,4-1,6 см/мин при комнатной температуре. Фотометрический детектор с длиной волны пропускаемого света 254 нм. Перед началом измерений хроматограф прогревают 15 мин и параллельно колонку промывают элюентом до установления постоянства нулевой линии и времени удерживания витамина А, проверяемого по стандартному раствору.
При использовании хроматографов других марок подбирают оптимальные условия для хроматографирования (объем пробы, скорость элюирования).
3.3 Проведение испытания
В коническую колбу вместимостью 250 см, снабженную обратным холодильником, помещают 5-10 г премикса (в зависимости от рецепта премикса), добавляют 50 см 10%-ного спиртового раствора гидроокиси калия, на конце скальпеля - пирогаллол, помещают на водяную баню и омыляют при температуре 80-85 °С в течение 30 мин. Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды, добавляют 50 см дистиллированной воды и 50 см гексана, дают отстояться и осторожно сливают верхний гексановый слой в делительную воронку. Экстракцию раствора в колбе повторяют дважды порциями по 40 см гексана, последнюю фракцию фильтруют через воронку с марлевым слоем. Объединенные гексановые вытяжки промывают в делительной воронке дистиллированной водой до нейтральной среды (по универсальному индикатору). Промытый экстракт переносят в перегонную колбу через беззольный фильтр (красная лента), заполненный безводным сульфатом натрия (40-50 г). Делительную воронку и сульфат натрия на фильтре промывают два раза порциями по 20 см гексана. Гексан из колбы отгоняют на ротационном испарителе при температуре 70 °С. Сухой остаток растворяют в 10 см гексана, который добавляют порциями по 2-3 см, и переносят в предварительно откалиброванную пробирку вместимостью 10 см с притертой пробкой.
Стандартный раствор витамина А обрабатывают параллельно. Отбирают 1 см стандартного раствора, выполняют омыление и экстрагируют, как при обработке образцов. Полученный экстракт витамина А в 10 см гексана используют для хроматографического анализа в качестве внешнего стандарта. Измерение проводят в нормально-фазном режиме.
Растворы экстрактов анализируемого образца и стандартного раствора хроматографируют в одинаковых условиях. С помощью микрошприца в колонку вводят испытуемые растворы (экстракт стандарта или анализируемого образца). При низком содержании витамина А в премиксе загрузку растворов в колонку увеличивают. Получают хроматограммы, аналогичные приведенным на черт.3. Измеряют высоты пиков, соответствующих времени удержания витамина А, как расстояния от вершины пиков до линии, проведенной в основании пика. Эти значения используют в дальнейшем для расчета содержания витамина А в испытуемом образце. Наиболее благоприятные условия для определения создаются, когда высоты пиков стандарта и определяемого вещества на хроматограмме соизмеримы. Эти условия могут быть созданы изменением концентрации стандартного раствора или объемов загрузки в хроматограф экстрактов стандарта и премикса.
Черт.3. Хроматограммы экстрактов
Хроматограммы экстрактов
a - стандартный раствор витамина А; б - премикс
Черт.3
3.4 Обработка результатов
Содержание витамина 
, МЕ/г, вычисляют по высотам пиков хроматограмм экстрактов стандартного раствора и испытуемых образцов по формуле
,
где 
- количество витамина А, используемое для приготовления стандартного раствора, ME;
- аликвота стандартного раствора, используемая на омыление, см;
- объем мерной колбы со стандартным раствором витамина А, см; - масса навески премикса, используемая на омыление, г;
, 
- объемы загрузки в хроматограф пробы стандарта и премикса, мкдм;
, 
- высоты пиков премикса и стандарта на хроматограмме, мм.
За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений. Результаты вычисляют до четвертой значащей цифры и округляют до третьей значащей цифры.
Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений при доверительной вероятности 
=0,95 не должны превышать 10% относительно среднеарифметического значения, а между результатами, полученными в разных условиях, - 15%.
4 Колориметрический метод определения витамина А
Сущность метода заключается в омылении пробы премикса спиртовым раствором щелочи, экстракции неомыленной фракции этиловым эфиром и колориметрическом измерении оптической плотности испытуемого раствора с треххлористой сурьмой.
Метод применяют для определения витамина А в премиксах, не содержащих кормовой концентрат лизина.
4.1 Аппаратура, реактивы и материалы
Фотоэлектроколориметр марки КФК-2 или других аналогичных марок со спектральным диапазоном работы 315-980 нм.
Спектрофотометр со спектральным диапазоном работы 186-1100 нм.
Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104.
Шкаф сушильный с терморегулятором, обеспечивающий постоянство температуры (110±2) °С.
Испаритель ротационный по ГОСТ 15150 или аналогичный.
Баня водяная.
Скальпель.
Воронки делительные вместимостью 250, 500 см по ГОСТ 25336.
Колбы конические со шлифом вместимостью 250 и 100 см по ГОСТ 25336.
Холодильник обратный по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 1(2)-50-1(2) и 1(2)-100-1(2) по ГОСТ 1770.
Пипетки 1(2, 4, 5)-1(2)-1; 2(4, 5)-1(2)-2; 2(6, 7)-1(2)-5; 2(6, 7)-1(2)-10.
Цилиндры 1(2, 3, 4)-25; 1(2, 3, 4)-50; 1(2, 3, 4)-100; 1(2, 3, 4)-500 по ГОСТ 1770.
Склянки с притертой пробкой.
Эксикатор по ГОСТ 25336.
Воронки стеклянные по ГОСТ 25336.
Насос водоструйный по ГОСТ 25336.
Ретинола ацетат в масле, 3,44%-ный раствор с активностью 90000-110000 МЕ/см по фармакопее.
Ангидрид уксусный по ГОСТ 5815.
Эфир этиловый по фармакопее.
Хлороформ по ГОСТ 20015 или ГФХ.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363 или натрия гидроокись по ГОСТ 4328, растворы с массовой долей 50%.
Калий йодистый по ГОСТ 4232, раствор с массовой долей 10%.
Калий марганцевокислый по ГОСТ 20490, раствор с массовой долей 4%.
Кислота серная по ГОСТ 4204.
Кислота соляная по ГОСТ 3118.
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166.
Пирогаллол А по ТУ 6-09-5319.
Сурьма треххлористая.
Спирт этиловый абсолютированный по ТУ 84-11-99.
Спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300 или по ГОСТ 5962*.
Уголь активный по ГОСТ 6217.
Кальция окись по ГОСТ 8677.
Фенолфталеин.
Крахмал.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Фильтры бумажные.
Примечание - При проведении испытаний допускается использовать импортные аппаратуру, материалы и реактивы с характеристиками не ниже отечественных аналогов.
4.2 Подготовка к испытанию
4.2.1 Приготовление безводного сернокислого натрия
Реактив высушивают в сушильном шкафу при температуре 105-110 °С в течение 3 ч.
4.2.2 Проверка этилового эфира на содержание перекисей
20 см этилового эфира взбалтывают с 2 см бесцветного раствора йодистого калия с массовой долей 10% в цилиндре с притертой пробкой вместимостью 25 см и оставляют на 1 ч в темном месте. Не должно быть пожелтения ни эфирного, ни водного слоев. Водный слой сравнивают с исходным раствором йодистого калия. Пожелтение раствора указывает на присутствие перекисей, от которых его очищают следующим образом.
В склянку с притертой пробкой помещают 500 см эфира, 50 см раствора марганцевокислого калия с массовой долей 4%, 4 см раствора гидроокиси натрия или гидроокиси калия с массовой долей 50%, взбалтывают и оставляют в темноте на 1 сут. Затем смесь переносят в делительную воронку и эфир промывают пять-шесть раз водой в соотношении 2:1, высушивают путем фильтрования через прокаленный безводный сернокислый натрий и перегоняют. Очищенный от перекисей эфир хранят в холодильнике.
4.2.3 Проверка хлороформа на присутствие свободного хлора и его очистка
10 см хлороформа взбалтывают в делительной воронке с 40 см воды, затем водный слой отделяют. К 10 см водного слоя добавляют 0,5 см раствора йодистого калия с массовой долей 10% и 0,5 см раствора крахмала с массовой долей 1%. В присутствии свободного хлора водный слой окрашивается в синий цвет. В этом случае хлороформ промывают водой (на две части хлороформа берут одну часть воды). Взбалтывают, дают жидкости расслоиться и нижний слой - хлороформ сливают в склянку, а верхний - воду отбрасывают. Промывают хлороформ пять-шесть раз, затем для обезвоживания добавляют в него безводный сернокислый натрий и ставят в темное место на 30 мин. После этого хлороформ отгоняют и хранят в темной склянке в прохладном месте.
4.2.4 Приготовление раствора треххлористой сурьмы
Для приготовления раствора треххлористой сурьмы в хлороформе берут на каждые 100 см хлороформа 23 г треххлористой сурьмы, растворяют при нагревании на водяной бане при температуре около 40 °С и оставляют в темном месте на 7 сут для выделения примесей и воды. Прозрачный раствор сливают в темную склянку, фильтруя через фильтр с безводным сульфатом натрия, добавляют в него 2% уксусного ангидрида (по объему), закрывают притертой пробкой и хранят в прохладном месте. При появлении в процессе хранения мутного осадка раствор использованию не подлежит.
4.2.5 Определение активности витамина А в масляном препарате - по 2.2.5.
4.2.6 Построение градуировочного графика
Точную навеску масляного препарата, содержащего около 100 тыс. ME витамина А - ретинола ацетата, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см и растворяют в хлороформе. Получают основной раствор с активностью 1000 ME витамина А в 1 см.
Из полученного основного раствора готовят рабочие растворы, содержащие 5, 10, 15, 20, 25, 30 ME витамина А в 1 см. Для этого соответственно 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 см основного раствора помещают в мерные колбы вместимостью 100 см и объем в колбах доводят хлороформом до метки.
Из каждого рабочего раствора отбирают в кювету с толщиной слоя 1 см фотоэлектроколориметра 0,4 см и вносят в нее 4 см раствора треххлористой сурьмы.
Интенсивность образовавшейся окраски определяют на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре и длине волны 590 нм не позднее 5 с после внесения раствора треххлористой сурьмы.
По полученным данным строят градуировочный график.
При смене реактивов, особенно раствора треххлористой сурьмы в хлороформе, градуировочный график строят вновь.
Отмывку кювет после треххлористой сурьмы проводят водным раствором соляной кислоты (1:1) с последующим неоднократным ополаскиванием водой. Растворы витамина А готовят в день построения градуировочного график
4.3 Проведение испытания
Навеску премикса массой 2-5 г помещают в колбу вместимостью 200-250 см, снабженную обратным холодильником, приливают 50 см 96%-ного этилового спирта, добавляют 40-50 мг пирогаллола (на кончике скальпеля) и ставят в кипящую баню для омыления. В момент начала кипения прибавляют 5 см раствора гидроокиси калия или натрия с массовой долей 50%.
Омыление проводят в течение 30 мин с момента начала кипения, периодически взбалтывая, по истечении этого времени содержимое колбы быстро охлаждают под струей воды до комнатной температуры.
Для экстракции витамина А в колбу добавляют 50 см эфира, хорошо взбалтывают и содержимое колбы переносят в делительную воронку вместимостью 500 см, в которую предварительно вносят около 50 см дистиллированной воды. Экстракцию витамина А эфиром проводят трехкратно порциями по 30-50 см.
Все эфирные вытяжки собирают в делительную воронку и промывают дистиллированной водой до исчезновения щелочной реакции промывных вод (проба с фенолфталеином).
Затем эфирную вытяжку обезвоживают путем пропускания через бумажный фильтр, на который помещен безводный сернокислый натрий. Последний промывают несколькими порциями эфира, который фильтруют в ту же колбу.
Эфир отгоняют досуха на водяной бане при температуре не выше 50 °С в токе азота или под вакуумом, используя водоструйный насос или ротационный испаритель. Сухой остаток сразу же растворяют в хлороформе, переносят в мерную колбу вместимостью 50-100 см (в зависимости от содержания витамина А в рецепте премикса) и объем доводят до метки хлороформом. Допускается проводить омыление и экстрагирование, как указано в 3.3.
Далее проводят цветную реакцию с раствором треххлористой сурьмы, как описано при построении градуировочного графика. Интенсивность окраски устанавливают на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром (длина волны 590 нм) относительно хлороформа в кювете с толщиной слоя 1 с
4.4 Обработка результатов
Содержание витамина А (
), в миллионах ME на тонну премикса, вычисляют по формуле
,
где 
- содержание витамина А, найденное по градуировочному графику, МЕ/см; - объем разведения, см; - масса навески премикса, г.
При необходимости (в зависимости от содержания витамина А в рецепте премикса) делают дополнительное разведение, которое учитывают в формуле.
За окончательный результат испытания принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 15% относительно среднего арифметического значения.