ГОСТ 25384-82
(СТ СЭВ 2597-80)
Группа С79
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
ЖИВОТНЫЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ
Методы лабораторной диагностики ящура
Domestic animals. Methods of laboratory diagnostics of foot-and-mouth disease
Срок действия с 01.01.83
до 01.01.88*
_______________________________
* Ограничение срока действия снято
по протоколу Межгосударственного Совета
по стандартизации, метрологии и сертификации
(ИУС N 2, 1993 год). - Примечание изготовителя базы данных.
РАЗРАБОТАН Министерством сельского хозяйства СССР
ИСПОЛНИТЕЛЬ Ж.А.Шажко
ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР
Член Коллегии А.Д.Третьяков
УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 11 августа 1982 г. N 3155
Настоящий стандарт распространяется на крупный и мелкий рогатый скот, свиней, верблюдов, а также на все виды диких парнокопытных и мозоленогих животных, восприимчивых к ящуру, и устанавливает методы лабораторной диагностики ящура.
Стандарт предназначается для научно-исследовательских учреждений, республиканских и областных (краевых) ветеринарных лабораторий.
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 2597-80.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ
1.1. Для проведения диагностических исследований на ящур отбирают стенки и содержимое афт (лимфа) на слизистой оболочке языка (у крупного рогатого скота), на пятачке (у свиньи), на коже венчика и межпальцевой щели (у крупного и мелкого рогатого скота, свиней, верблюдов и др.). При отсутствии афт отбирают пробы крови в момент температурной реакции у животных, а из трупов молодняка всех видов животных - лимфатические узлы головы и заглоточного кольца, поджелудочную железу и мышцу сердца.
Для проведения ретроспективных диагностических исследований на ящур отбирают пищеводно-глоточную слизь. Отбор пищеводно-глоточной слизи производят в любое время после предполагаемого заболевания животных.
1.2. Для проведения диагностики серологическим методом отбирают не менее 5 г стенок или содержимого афт. Масса проб остальных материалов, предназначенных для выделения вируса ящура и его последующей идентификации, должна быть не менее 10 г.
При невозможности получения указанных количеств проб допускается отбирать максимально возможное количество патологического материала для проведения последующей расплодки вируса в культурах клеток.
1.3. Пробы патологического материала без признаков разложения помещают во флаконы с завинчивающимися или притертыми пробками и замораживают, а при отсутствии условий замораживания - заливают консервирующей жидкостью. Для консервирования стенок и содержимого афт используют консервирующую жидкость, состоящую из равных объемов нейтрального глицерина и забуференного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток (без сыворотки). Пробы остального патологического материала консервируют растворами антибиотиков с широким спектром действия или глицерин-фосфатным буфером.
1.4. Флаконы с пробами снабжают этикеткой с указанием вида животных, наименования патологического материала и его количества, консерванта, времени отбора и адреса отправителя. Флаконы с пробами помещают в небьющийся контейнер со льдом или хладоносителем и доставляют на исследование в возможно короткий срок, но не позднее 48 ч с момента отбора. Если пробы могут быть доставлены в течение 6-12 ч с момента отбора, замораживание и консервация проб не обязательны.
1.5. Поступившие на исследование стенки афт освобождают от консервирующей жидкости отмыванием в 2-3 сменах стерильного 0,15 М раствора хлористого натрия или среды для культивирования клеток, взвешивают, измельчают сначала ножницами, а затем в ступке с песком или с помощью гомогенизатора и смешивают в соотношении 1:1 или 1:2 с 0,15 М раствором хлористого натрия. Полученные 50 или 33% суспензии выдерживают в течение 20 мин при температуре 4 °С, а затем очищают 20% (по объему) хлороформа или флюорокарбона в течение 5-7 мин и осветляют центрифугированием с частотой вращения 3000 об/мин в течение 15 мин.
1.6. Содержимое афт (лимфа) разбавляют равным количеством 0,15 М раствора хлористого натрия и подвергают очистке и осветлению в соответствии с п.1.5.
1.7. Пробы лимфоузлов, мышцы сердца, поджелудочной железы и свернувшейся крови сначала обрабатывают в соответствии с п.1.5, а затем разбавляют средой для культивирования клеток.
Полученные суспензии при невозможности немедленно использовать для постановки биопробы замораживают и хранят при температуре минус 20 °С.
1.8. Суспензии, полученные в соответствии с пп.1.5 и 1.6, делят на три неравные части. Меньшую из них (около 1 см
), предназначенную для вирусологических исследований (постановки биопробы), консервируют антибиотиками и хранят при температуре минус 20 °С. Другую часть (2-3 см), предназначенную для исследования в РСК, прогревают при температуре 56 °С в течение 40 мин, а оставшуюся (1,5-2 см) - хранят без прогревания. Перед постановкой РСК обе эти пробы центрифугируют в течение 20 мин с частотой вращения 3500-4000 об/мин.
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Серологический метод
Сущность метода заключается в обнаружении специфического антигена того или иного типа и варианта вируса ящура непосредственно в материале, полученном от животных с клиническими признаками заболевания, с помощью реакции связывания комплемента (РСК).
2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы
2.1.1.1. Для проведения исследования применяют:
центрифугу настольную с угловым ротором и частотой вращения до 5000 об/мин;
центрифугу рефрижераторную;
холодильник с температурой минус 20 °С;
холодильник с температурой от 0 до 8 °С;
гомогенизатор;
баню водяную или термостат;
шкаф сушильный с регулируемой температурой в диапазоне от 100 до 200 °С;
электрофотоколориметр или спектрофотометр;
пробирки стеклянные по ГОСТ 10515-75;
пластинки (панели) для микросерологических реакций типа Такачи;
наборы разбавителей и капельниц для микросерологических реакций типа Такачи;
пипетки вместимостью до 10 см с ценой деления 0,01 и 0,1 см по ГОСТ 20292-74*;
________________
* На территории Российской Федерации действуют ГОСТ 29169-91, ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91, ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.
колбы мерные вместимостью 50, 100 и 200 см по ГОСТ 1770-74;
комплемент морской свинки с титром не более 2,8% по ГОСТ 16446-78;
гемолизин кроличий к эритроцитам барана с титром 1:8000 по ГОСТ 16446-78;
эритроциты барана в виде дефибринированной крови, смешанной с равным объемом консерванта;
сыворотки морских свинок семи типов и актуальных для стран-членов СЭВ вариантов вируса ящура с титром в РСК не ниже 1:20;
антигены ящурные эталонные семи типов и актуальных для стран-членов СЭВ вариантов вируса с титром в РСК не ниже 1:4;
сыворотки и антигены для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний свиней;
кислоту борную дважды перекристаллизованную;
веронал;
мединал;
глюкозу по ГОСТ 975-75*;
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 975-88. - Примечание изготовителя базы данных.
натрий хлористый по ГОСТ 4233-77;
магний хлористый по ГОСТ 4209-77, х.ч.;
кальций хлористый по ГОСТ 4460-77, х.ч.;
среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактальбумина (рН 7,4-7,6);
хлороформ по ГОСТ 20015-74* или флюорокарбон-113;
________________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 20015-88. - Примечание изготовителя базы данных.
консервант для эритроцитов; приготовленный следующим образом: последовательно растворяют в 100 см дистиллированной воды 6 г глюкозы, 4,5 г борной кислоты, дважды перекристаллизованной, и 0,85 г хлористого натрия. Полученный раствор стерилизуют кипячением в течение 3 дней по 30 мин;
раствор буферный веронал-мединаловый концентрированный, приготовленный следующим образом: растворяют в 1000 см кипящей дистиллированной воды 83 г хлористого натрия, 18,4 г веронала, 1,15 г хлористого магния и 0,22 г хлористого кальция. Раствор охлаждают, затем растворяют 0,22 г мединала, стерилизуют автоклавированием и хранят при температуре 4 °С. Рабочий раствор готовят непосредственно перед постановкой РСК разбавлением концентрированного раствора четырьмя объемами дистиллированной воды.
2.1.2. Подготовка к исследованию
2.1.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп.1.5, 1.6 и 1.8, разводят с 1:2 до 1:32 0,15 М раствором хлористого натрия, вероналовым буфером или средой для культивирования клеток и разливают в серологические пробирки по 0,1 см или в лунки панелей для микросерологических реакций по 0,025 см. Число пробирок (лунок), заполняемых каждым разведением исследуемой суспензии, должно быть равно числу штаммоспецифических сывороток и контролей на антикомплементарность и гемолитические свойства.
2.1.2.2. Для приготовления гемолитической системы эритроциты барана трехкратно отмывают от консерванта 0,15 М раствором хлористого натрия, каждый раз осаждая их центрифугированием с частотой вращения 600 об/мин в течение 5-7 мин и готовят рабочую суспензию смешиванием 2 см осадка с 98 см разбавителя. К полученной суспензии эритроцитов при постоянном перемешивании приливают постепенно равный объем гемолизина, разведенного 0,15 М раствором хлористого натрия с таким расчетом, чтобы его конечное разведение было в 4 раза концентрированнее предельного гемолитического титра, указанного на этикетке. Затем суспензию выдерживают в течение 15-20 мин в водяной бане при температуре 37 °С или при комнатной температуре.
При постановке РСК на панелях для микрореакций концентрацию эритроцитов в гемсистеме увеличивают в 2 раза.
2.1.2.3. Для приготовления рабочего разведения комплемента содержимое нескольких ампул с сухим препаратом растворяют в первоначальном объеме дистиллированной воды, определяют предельный титр, обусловливающий гемолиз 50% эритроцитов гемсистемы, приготовленной согласно п.2.1.2.2, и разводят 0,15 М раствором хлористого натрия или вероналовым буфером из расчета 5 CH
в 0,1 см (если РСК ставят в пробирках) или в 0,025 см (при постановке РСК на панелях для микрореакций).
2.1.2.4. Рабочие разведения типоспецифических ящурных сывороток готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или вероналовом буфере из расчета получения раствора в 2 раза более концентрированного, чем их предельный титр, т.е. они должны содержать 2 сывороточных единицы (СЕ). Вариантноспецифические сыворотки разводят до предельного титра. Вместо типоспецифических сывороток могут быть использованы вариантноспецифические в предельном, двух- и четырехкратном титрах (1, 2 и 4 СЕ).
2.1.2.5. Рабочие разведения эталонных (контрольных) яшурных антигенов готовят на 0,15 М растворе хлористого натрия или вероналовом буфере. Они должны быть в 2 раза концентрированнее, чем их предельный титр, т.е. должны содержать 2 антигенных единицы (АЕ).
2.1.2.6. Рабочие разведения сывороток и антигенов для лабораторной диагностики везикулярных заболеваний сельскохозяйственных животных готовят по пп.2.1.2.4 и 2.1.2.5.
2.1.3. Проведение исследования
2.1.3.1. В пробирки (лунки), заполненные в соответствии с п.2.1.2.1, вносят равные объемы штаммоспецифических сывороток, взятых в рабочем титре, и рабочего разведения комплемента, содержащие 5 CH. В контролях исследуемого патологического материала на антикомплементарность заменяют сыворотки равным объемом разбавителя, а в контроле на гемолитические свойства - разбавителем заменяют и комплемент. Все полученные смеси тщательно встряхивают и помещают в водяную баню пли термостат при 37 °С на 30 мин, после чего к ним добавляют суспензию эритроцитов, сенсибилизированных гемолизином, в объеме 0,2 см (пробирки) или 0,05 см (лунки), энергично встряхивают и выдерживают при 37 °С в течение 20 мин.
Пробирки или панели извлекают из термостата или водяной бани и осаждают эритроциты центрифугированием в течение 5 мин с частотой вращения 600 об/мин или отстаиванием в течение 2-3 ч при комнатной температуре.
При исследовании недоброкачественных афтозных материалов, а также при исследовании сердечной мышцы объем исследуемых суспензий увеличивают в 4 раза при сохранении объема и концентрации остальных компонентов реакции в обычных пределах.
Для повышения чувствительности РСК применяют реакцию длительного связывания комплемента (РДСК), при которой первая фаза протекает при 4 °С в течение 16-20 ч.
2.1.4. Обработка результатов
Оценку результатов проводят визуально.
Реакцию считают положительной, если в ряду пробирок (лунок) с какой-либо штаммоспецифической сывороткой отмечается задержка гемолиза не менее 50% эритроцитов при полном гемолизе в параллельных рядах с другими штаммоспецифическими сыворотками и в контроле с пробами патологического материала на антикомплементарность. Возбудитель относится к тому варианту вирусов ящура, с сывороткой которого титр исследуемой суспензии окажется выше.
Отрицательная реакция не исключает ящура или иного сходного с ним заболевания, поскольку концентрация вирусоспецифического антигена в исследуемом материале может оказаться слишком низкой для обнаружения в РСК.
2.2. Методы выявления вируса
Сущность методов заключается в выявлении биологического действия вируса на восприимчивые и чувствительные биологические системы и его последующей идентификации серологическим методом.
2.2.1. Аппаратура, материалы и растворы
2.2.1.1. Для проведения исследования применяют:
термостат с температурой нагрева 37 °С;
пипетки вместимостью до 10 см с ценой деления 0,01 см по ГОСТ 20292-74;
культуры монослойные первичных клеток почки свиней (СП), телят, взрослого крупного рогатого скота (ВП) и ягнят (ПЯ) и перевиваемых линий ВНК-21 и IB-RS-2 в пробирках и флаконах вместимостью 50, 100, 500 и 1000 см;
среду питательную для культивирования клеток с 0,5% гидролизата лактабумина (рН 7,4-7,6);
среду питательную Игла для культивирования клеток перевиваемых линий;
раствор Хенкса солевой, рН 7,2-7,4.
2.2.2. Подготовка к исследованию
2.2.2.1. Суспензии стенок и содержимого афт, полученные в соответствии с пп.1.5, 1.6 и 1.8, и оказавшиеся неактивными в РСК, а также суспензии лимфатических узлов, сердечной мышцы, поджелудочной железы, свернувшейся крови и пищеводно-глоточную слизь, полученные в соответствии с пп.1.7 и 1.9, используют для заражения монослойных культур первичнотрипсинизированных клеток (СП, ВП, ПЯ, щитовидной железы крупного рогатого скота), перевиваемых линий (ВНК-21 и IB-RS-2), десять мышат 3-6-дневного возраста и пять морских свинок. Допускается заражение двух голов крупного рогатого скота в 18-месячном возрасте и четырех поросят 3-месячного возраста, не содержащих в крови специфических антител.
2.2.3. Проведение исследования
2.2.3.1. Проведение биопробы на культурах клеток
Отбирают пробирки (флаконы) с хорошо сформированным монослоем без признаков старения и неспецифической дегенерации. На каждую пробу исследуемого материала берут по 10 пробирок или по 2-3 флакона с перечисленными клеточными культурами. Непосредственно перед инокуляцией культуры дважды отмывают от ростовой питательной среды раствором Хенкса. Затем в пробирочные культуры вносят по 0,1-0,2 см, а во флаконы от 0,5 до 10 см (в зависимости от площади монослоя) исследуемых суспензий. Инокулированные культуры выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 60 мин, затем освобождают от исследуемой суспензии и заливают поддерживающей питательной средой. Одновременно ставят контроль на цитотоксичность раствора Хенкса. Инокулированные контрольные культуры помещают в термостат при температуре 37 °С и в течение 7 дней проводят микроскопию для выявления дегенерации клеток. В случае обнаружения дегенерации только в инокулированных культурах проводят дополнительный пассаж культуральной суспензии, полученной после однократного промораживания культур с дегенерацией монослоя при температуре минус 20 °С. Полученную при этом суспензию осветляют центрифугированием в течение 15 мин с частотой вращения 3000 об/мин и затем заражают исходные культуры в том же порядке, который предусмотрен для исследуемых суспензий проб патологического материала.
Специфичность дегенерации клеток проверяют в РСК.
2.2.3.2. Постановка биопробы на животных
Биопробу ставят на морских свинках, мышатах 3-6-суточного возраста и естественно-восприимчивых к ящуру животных.
Используют клинически здоровых особей, в анамнезе которых полностью исключены предварительные контакты с вирусом ящура. Мышатам исследуемую суспензию инокулируют подкожно в дозе 0,1 см, морским свинкам - в кожу подушечек обеих задних конечностей методом тунелирования в дозе 0,2-0,5 см. Крупному рогатому скоту материал вводят в толщу эпителия языка и в мякиши всех конечностей в дозе 2-3 см. За инокулированными животными наблюдают в течение 7 дней. В случае гибели подопытных мышат проводят дополнительный пассаж материала, приготовленного из тушек павших мышат, и исследование в РСК в соответствии с п.2.1.
При появлении у остальных видов животных везикулярных поражений кожи в местах инокуляции исследуемого материала отбирают пробы содержимого афт в соответствии с п.1.2, готовят из них суспензии в соответствии с пп.1.5 и 1.6 и исследуют в РСК в соответствии с п.2.1.
2.2.4. Обработка результатов
2.2.4.1. Пробу исследуемого патологического материала считают отрицательной, если во втором и последующем пассажах не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышат, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.