ГОСТ 25311-82
Группа С19
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
МУКА КОРМОВАЯ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Методы бактериологического анализа
Feeding flour of animal origin.
Methods of bacteriological analysis
ОКСТУ 9209
Дата введения 1983-07-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством мясной и молочной промышленности СССР
РАЗРАБОТЧИКИ
А.Ф.Савченко, канд. техн. наук; В.Г.Дедаш, канд. вет. наук; А.Е.Широченко, канд. биолог. наук; Н.В.Луданова, старший инженер
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 17.06.82 N 2421
3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД, на который дана ссылка | Номер пункта |
ГОСТ 171-81 | 2.1 |
ГОСТ 195-77 | 2.1 |
ГОСТ 779-55 | 2.1 |
ГОСТ 975-88 | 2.1 |
ГОСТ 1770-74 | 2.1 |
ГОСТ 1791-67 | 2.1 |
ГОСТ 2493-75 | 2.1 |
ГОСТ 3164-78 | 2.1 |
ГОСТ 4025-95 | 2.1 |
ГОСТ 4147-74 | 2.1 |
ГОСТ 4159-79 | 2.1 |
ГОСТ 4198-75 | 2.1 |
ГОСТ 4209-77 | 2.1 |
ГОСТ 4232-74 | 2.1 |
ГОСТ 4328-77 | 2.1 |
ГОСТ 4523-77 | 2.1 |
ГОСТ 4530-76 | 2.1 |
ГОСТ 5541-76 | 2.1 |
ГОСТ 5556-81 | 2.1 |
ГОСТ 5821-78 | 2.1 |
ГОСТ 5833-75 | 2.1 |
ГОСТ 5962-67 | 2.1 |
ГОСТ 6259-75 | 2.1 |
ГОСТ 6672-75 | 2.1 |
ГОСТ 6691-77 | 2.1 |
ГОСТ 6709-72 | 2.1 |
ГОСТ 7031-75 | 2.1 |
ГОСТ 7164-78 | 2.1 |
ГОСТ 8253-79 | 2.1 |
ГОСТ 9147-80 | 2.1 |
ГОСТ 9284-75 | 2.1 |
ГОСТ 9412-93 | 2.1 |
ГОСТ 9569-79 | 2.1 |
ГОСТ 9958-81 | 3.1 |
ГОСТ 11109-90 | 2.1 |
ГОСТ 11293-89 | 2.1 |
ГОСТ 12026-76 | 2.1 |
ГОСТ 13739-78 | 2.1 |
ГОСТ 13805-76 | 2.1 |
ГОСТ 16317-87 | 2.1 |
ГОСТ 17206-96 | 2.1 |
ГОСТ 17536-82 | 1.1 |
ГОСТ 18300-87 | 2.1 |
ГОСТ 18963-73 | 3.1 |
ГОСТ 20729-75 | 2.1 |
ГОСТ 20730-75 | 2.1 |
ГОСТ 21237-75 | 3.1 |
ГОСТ 23683-89 | 2.1 |
ГОСТ 24104-88 | 2.1 |
ГОСТ 25336-82 | 2.1 |
ГОСТ 25706-83 | 2.1 |
5. Ограничение срока действия снято по протоколу N 2-92 Межгосударственного Совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 2-93)
6. ПЕРЕИЗДАНИЕ с Изменением N 1, утвержденным в декабре 1987 г. (ИУС 4-88)
Настоящий стандарт распространяется на кормовую муку животного происхождения и устанавливает методы бактериологического анализа:
определение общего количества микробов;
определение присутствия бактерий группы кишечной палочки;
определение присутствия бактерий из рода сальмонелл;
определение присутствия бактерий анаэробов.
1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ
1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ
1.1. Отбор проб для бактериологического анализа проводят по ГОСТ 17536 сухим стерильным щупом в сухую стерильную стеклянную банку.
1.2. Масса точечной пробы должна быть не менее 100 г. Масса объединенной пробы должна быть не менее 500 г.
1.3. Объединенную пробу тщательно перемешивают и делят пополам. Каждую часть упаковывают в стерильную стеклянную банку. Одну банку направляют в лабораторию, а другую сохраняют на предприятии до окончания анализа.
1.4. При отборе проб составляют акты в двух экземплярах, которые должны содержать следующие данные: наименование предприятия-изготовителя, номер партии, вид и массу продукта, количество упаковочных единиц, дату изготовления продукции и отбора проб.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ
2.1. Для проведения бактериологических анализов применяют следующие аппаратуру, материалы и реактивы:
автоклав;
анаэростат;
весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104* 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г;
_______________
* С 1 июля 2002 г. вводится в действие ГОСТ 24104-2001.
гомогенизатор бактериологический, смеситель или аппарат для измельчения тканей с частотой вращения не менее 8000 об/мин;
дистиллятор;
лупы измерительные с увеличением 3
и 5 по ГОСТ 25706;
лампы ртутно-кварцевые;
микроскоп марок МБИ и МБР по НТД или других аналогичных марок;
мясорубку бытовую по ГОСТ 4025;
потенциометр по ГОСТ 7164;
прибор для подсчета колоний;
термостат электрический с автоматическим терморегулятором;
холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317;
шкаф сушильный лабораторный;
агар микробиологический по ГОСТ 17206;
агар сухой с эозином метиленовым синим (среда Левина);
агар Эндо сухой бактериологический;
агар Плоскирева сухой бактериологический;
агар сухой висмут-сульфит;
альфанафтиламин по НТД;
алхилбензолсульфонат;
баню водяную с терморегулятором;
бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
бумагу парафинированную по ГОСТ 9569*;
_________________
* С 01.01.2008 на территории Российской Федерации действует ГОСТ 9569-2006. - Примечание изготовителя базы данных.
бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;
вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;
воду мясную по ГОСТ 20729;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
воронки стеклянные по ГОСТ 25336;
дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 171;
желатин пищевой по ГОСТ 11293;
колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336;
кристаллизатор с мостиком;
марлю бытовую по ГОСТ 11109;
марлю медицинскую по ГОСТ 9412;
масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164;
мел химический осажденный по ГОСТ 8253;
мясо-говядину по ГОСТ 779;
набор углеводов для исследования ферментации микробов кишечной группы (большой);
набор адсорбированных поливалентных сальмонеллезных 0-сывороток основных пяти групп (А, В, С, Д, Е) и редких групп;
набор 0-моно и поливалентных агглютинирующих колисывороток;
палочки стеклянные;
парафин по ГОСТ 23683;
пептон венгерский фирмы "Рихтер", чешский "Спофа";
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805;
песок кварцевый для тонкой керамики по ГОСТ 7031;
печень говяжью;
пинцеты для предметных стекол;
пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10 см
с ценой деления 0,1 см с широким концом;
пипетки Мора вместимостью 25, 50 см;
пипетки пастеровские;
поплавки для пробирок и колб длиной 20, 45 и 75 мм и диаметром 5, 9 и 10 мм соответственно;
препарат с индикатором ВР и глюкозой;
пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 25336;
пробки корковые по ГОСТ 5541*;
_______________
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ 5541-2002. - Примечание изготовителя базы данных.
пробки резиновые конусные по НТД;
проволоку из никелевых сплавов диаметром 0,3-0,5 мм по ГОСТ 1791;
стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672;
стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284;
ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147;
среду КОДА сухую питательную;
флаконы Сокслета;
цилиндры мерные наливные 1-100, 1-250, 1-500 по ГОСТ 1770;
колбы мерные наливные 1-100-2, 1-250-2, 1-500-2 по ГОСТ 1770;
часы песочные на 1, 2, 5 мин;
чашки стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 типа ЧБН (чашки Петри);
шпатели Дригальского;
штативы для пробирок;
шумовку;
яйца куриные;
бриллиантовый зеленый;
бромкрезолпурпур;
бромтимоловый синий;
геницианвиолет;
глицерин по ГОСТ 6259, х.ч.;
глюкозу кристаллическую гидратную по ГОСТ 975, х.ч.;
железо хлористое по ГОСТ 4147;
йод по ГОСТ 4159, х.ч.;
калий йодистый по ГОСТ 4232;
калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч.;
калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493, ч.д.а.;
калий едкий;
кальций углекислый по ГОСТ 4530;
кислоту розоловую;
кислоту щавелевую;
кислоту сульфаниловую по ГОСТ 5821;
лактозу, х.ч.;
магний хлористый 6-водный по ГОСТ 4209, х.ч.;
магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523;
маннит по НТД, х.ч.;
метиленовый голубой;
мочевину по ГОСТ 6691, х.ч.;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
сахарозу по ГОСТ 5833, х.ч.;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962*;
_______________
* В Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652-2000.
спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;
фенолрот;
фуксин основной для микробиологических целей;
фуксин (основной и кислый) для микробиологических целей;
хинозол;
натрий сернистокислый безводный по ГОСТ 195.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ
3.1. Приготовление питательных сред: пептонной воды, мясо-пептонного агара (МПА), сред Эндо, Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука, Киллиана, Кауфмана, Мюллера, магниевой среды, селенитового бульона, Гисса, "ХБ" (хинозол-бромкрезол-пурпуровый), хлористо-магниевой среды "М" (модифицированной), среды Хейфеца, Булира, Кесслера, Эйкмана, Левина, Ресселя, Плоскирева, висмут-сульфит агара, КОДА, Крумвиде-Олькеницкого, полужидкого агара, кровяного агара по Цейслеру, среды Китт-Тароцци, короткого пестрого ряда среды Вильсон-Блера - производят по ГОСТ 9958, ГОСТ 18963, ГОСТ 21237 и по методикам, утвержденным в установленном порядке.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
3.2. Приготовление испытуемой взвеси и разведений
От общей пробы отвешивают на лабораторных весах навеску массой 50 г и помещают ее в стерильную колбу или стакан гомогенизатора, содержащий 450 см стерильного физиологического раствора, и тщательно перемешивают в течение 30 мин, получая основное десятикратное разведение. После отстаивания в течение 10-15 мин из надосадочного слоя берут пипеткой 1 см жидкости, вносят в пробирку с 9 см стерильного физиологического раствора и получают последующее разведение. Из этой пробирки готовят последующие разведения (тысячекратное и т.д.).
4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
4.1. Определение общего количества микробов в 1 г муки
4.1.1. Метод основан на способности живых бактериальных клеток образовывать макроколонии при оптимальных условиях культивирования на питательных средах.
4.1.2. По 1 см каждого разведения вносят в стерильные бактериологические чашки и заливают 10-15 см стерильного, расплавленного и охлажденного до 45 °С мясо-пептонного агара. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре (30,0±0,5) °С на 72 ч.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.1.3. Обработка результатов
Выросшие на чашках колонии подсчитывают, умножают на кратность соответствующего разведения. За общее количество микроорганизмов в 1 г муки принимают среднее арифметическое результатов двух смежных разведениий.
4.2. Определение присутствия бактерий группы кишечной палочки
4.2.1. Метод основан на способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять маннит и лактозу, образовывать на средах "ХБ" и Хейфеца кислые продукты, изменяющие цвет индикаторов, входящих в состав этих сред.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.2.2. По 1 см каждого разведения вносят (по выбору) в пробирки, содержащие по 5 см среды: Эйкмана, Кесслер, Булира, Хейфеца, "ХБ" или КОДА. Посевы помещают в термостат при температуре 43 °С для первых пяти сред и 37 °С для последней.
4.2.3. Через 24 ч учитывают рост на средах Эйкмана, Булира по помутнению среды и образованию газа, на средах Хейфеца, "ХБ" и КОДА - по изменению цвета сред.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.2.4. Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев в количестве 0,1-0,2 см на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина) и выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч.
Типичные колонии Е. Соli характеризуются круглой формой, выпуклой или слегка приподнятой в центре поверхностью, ровными краями, розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском или без него на среде Эндо и фиолетового или черного - на среде Левина.
Выросшие изолированные колонии (не менее 4) пересевают на мясо-пептонный бульон, выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 18-24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды, заражения мышей, вторую - для приготовления кипяченого антигена.
4.2.5. У выделенных культур изучают морфологические, культурально-биохимические и патогенные свойства с целью проведения их родовой дифференциации. Культурально-биохимические свойства изучают по комплексу ЛИМАЦ (лактоза+индол+метилрот+реакция фогес Проскауэра-, цитратно-аммонийные соли +).
Одновременно с определением морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств бактерий проводят серологическую типизацию культур кишечной палочки по 0-антигену.
Для приготовления антигена каждую предназначенную для типизации суточную агаровую культуру (пробирку со скошенным агаром) смывают стерильным физиологическим раствором, доводят суспензию бактерий до концентрации 5-6 млрд/см, кипятят в водяной бане в течение 1 ч и ставят реакцию агглютинации на стекле с комплексной 0-сывороткой, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:5.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.2.6. Если комплексные 0-колисыворотки в начальной реакции не агглютинируют антиген убитой нагреванием культуры, то готовят из этого штамма суспензию бактерий и автоклавируют ее при давлении 10
Па (1 атм) в течение 2 ч для разрушения термостабильного А-антигена. Автоклавированный антиген исследуют с сыворотками 08, 09, 0101.
4.2.7. Обработка результатов
При наличии агглютинации дают заключение о присутствии в исследуемой муке энтеропатогенных типов Е. Coli.
Кроме этого, энтеропатогенными признают культуры Е. Coli, которые:
серологически типизируются набором типоспецифических колисывороток, но не вызывают гибель белых мышей;
серологически не типизируются, но вызывают гибель белых мышей.
4.3. Определение присутствия бактерий из рода сальмонелл
4.3.1. Метод выявления сальмонелл основан на определении их характерного роста на элективных средах и установлении ферментативных и серологических свойств.
4.3.2. Навеску муки массой от 50 до 200 г помещают в колбу, содержащую одну из сред предварительного обогащения (физиологический раствор, пептонная вода) при соотношении муки и среды 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 16-18 ч производят посевы на две (по выбору) основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду, среды Киллиана, Мюллера, Кауфмана) в соотношении 1:5.
После 16-18 ч термостатирования при температуре 37 °С из обогатительных сред бактериологической петлей производят посевы в чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами висмут-сульфит агар, среды Плоскирева или Левина (по две чашки), которые помещают в термостат при температуре 37 °С.
4.3.3. Засеянные чашки просматривают через 24-48 ч.
На висмут-сульфит агаре S. typhi, S. paratyphi А растут в виде мелких, нежных серовато-зеленых колоний с черным центром; S. Cholerae suis - в виде зеленых колоний. Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, цвет участка среды под колонией - черный.
На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде прозрачных или нежно-розовых колоний; на среде Левина - прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые колонии.
При обнаружении колоний, подозрительных на сальмонеллы, три-пять из них засевают на комбинированные среды: Расселя, Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука или трехсахарную (лактоза, глюкоза, сахароза) "скошенный столбик" с мочевиной.
Высев колоний делают на короткий пестрый ряд, включающий скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой, а также на бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода.
Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, подвергаются серологическому исследованию - испытанию в реакции агглютинации на предметном стекле с поливалентной адсорбированной 0-сывороткой.
4.3.4. Обработка результатов
Обнаружение подвижных (кроме S. pullorum, S. gallinarum) грамотрицательных палочек, дающих характерный рост на элективных средах, не ферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа (S. typhi suis не ферментирует маннит), дающих положительную реакцию агглютинации с поливалентной адсорбированной 0-сывороткой, указывает на наличие бактерий из рода сальмонелл.
4.3.3, 4.3.4. (Измененная редакция, Изм. N 1).
4.4. Определение присутствия бактерий анаэробов
4.4.1. Метод основан на способности анаэробов расти в отсутствие кислорода воздуха, морфологии возбудителей, росте на питательных средах и на выявлении патогенности возбудителей путем заражения лабораторных животных.
4.4.2. В пробирки со средами Китт-Тароцци и Вильсон-Блера и в чашки с кровяным агаром по Цейслеру вносят по 1 см первых трех разведений испытуемой взвеси, помещают в термостат и инкубируют при температуре (37,0±0,5) °С в течение 24-48 ч.
Почернение среды Вильсон-Блера, а также быстрое начало роста на среде Китт-Тароцци при обильном газообразовании является характерным для С. perfringens. На кровяном агаре через 24 ч поверхность колоний С. perfringens слегка выпуклая, округлая, продолговатая, сочные колонии от серого до зеленого цвета, окружены большой зеленовато-коричневой зоной гемолиза. В мазках, приготовленных с кровяного агара, хорошо выражены капсулы и центрально расположенные, крупные овальные, по объему превышающие ширину палочки, споры. Биологическую пробу проводят на морских свинках и белых мышах путем внутрибрюшного заражения двухсуточной бульонной культурой. При положительном результате подопытные животные гибнут через 2-3 сут. Рост С. botulinum наблюдается на 2-3 сут. и характеризуется помутнением среды Китт-Тароцци, образованием осадка и запахом прогорклого масла. При исследовании на наличие токсина берут навеску муки массой не менее 50 г, помещают в колбу, содержащую стерильный физиологический раствор в соотношении 1:4. Подготовленный материал настаивают в течение 2-3 ч, затем центрифугируют и центрифугатом заражают внутрибрюшинно или подкожно морских свинок в дозе 1-2 см или белых мышей в дозе 0,2-0,3 см. Контрольным животным вводят подогретый на водяной бане при температуре 100 °С в течение 30 мин центрифугат в тех же дозах.
(Измененная редакция, Изм. N 1).
4.4.3. Обработка результатов
Наиболее характерные признаки роста С. perfringens - почернение среды Вильсон-Блера, интенсивный рост на среде Китт-Тароцци с обильным образованием газа, слегка выпуклые, круглые или продолговатые колонии серо-зеленоватого цвета на кровяном агаре. Биопробу считают положительной, когда подопытные животные погибают в течение двух суток после введения им центрифугата, не подвергнутого кипячению.