ГОСТ 25581-91
Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа

ГОСТ 25581-91

Группа С79

     

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПТИЦА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ, СИНАНТРОПНАЯ, ДИКАЯ И ЭКЗОТИЧЕСКАЯ

Методы лабораторной диагностики гриппа

Birds, poultry, synanthropos, game and exotic.
Methods of Avian Influenza laboratory diagnostics


ОКСТУ 9209

Дата введения 1993-01-01

     
     
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Московской ветеринарной академией им. К.И.Скрябина и Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов

РАЗРАБОТЧИКИ

Н.Г.Осидзе, д-р биол. наук; В.И.Смоленский, канд. вет. наук

2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 30.09.91 N 1575

3. Срок проверки - 1996 г., периодичность проверок - 5 лет

4. ВЗАМЕН ГОСТ 25581-83

5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

Обозначение НТД, на который дана ссылка

Номер пункта

ГОСТ 1770-74

2.1.1

ГОСТ 3118-77

2.3.1.1

ГОСТ 4159-79

2.1.1

ГОСТ 4233-77

2.1.1

ГОСТ 20292-74*

2.1.1

ГОСТ 22280-76

2.1.1

ГОСТ 25336-82

2.1.1

_________________
* На территории Российской Федерации действуют: ГОСТ 29169-91, ГОСТ 29227-91-ГОСТ 29229-91, ГОСТ 29251-91-ГОСТ 29253-91, здесь и далее по тексту. - Примечание.



Настоящий стандарт распространяется на сельскохозяйственную, синантропную, дикую и экзотическую птицу и устанавливает методы лабораторной диагностики гриппа.

1. ОТБОР ПРОБ

1. ОТБОР ПРОБ

1.1. Для проведения исследований отбирают пробы патологического материала:

головной мозг и селезенку или гортанные и клоакальные смывы от больной птицы в первые два дня заболевания или от птицы в агональном состоянии. Патологический материал помещают в термос со льдом или раствор глицерина с массовой долей 50%, приготовленный на физиологическом растворе с рН 7,2-7,4;

сыворотку крови больной и переболевшей птицы в количестве 1-2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа (не менее 20 проб).

1.2. Пробы крови для определения антител в сыворотке берут стерильно из подкрыльцовой вены в пробирки, увлажненные физиологическим раствором. Кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или термостате при 37 °С в течение 1-2 ч, затем осторожно обводят иглой или пастеровской пипеткой по стенке пробирки и оставляют на 16-18 ч при температуре 2-4 °С. Образовавшуюся прозрачную без гемолиза сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные пробирки.

Для ретроспективной диагностики используют парные пробы сывороток крови, полученные от больных и подозреваемых в заболевании птиц в начале заболевания и через 4-10 сут.

1.3. Пробы патологического материала и сывороток крови доставляют в лабораторию в термосе со льдом. К пробам прилагают сопроводительный документ, содержащий сведения о клинике, эпизоотологии заболевания, а также данные о результатах вскрытия трупов.

1.4. До начала лабораторного исследования патологический материал хранят в рефрижераторе при температуре 2-4 °С не более 24 ч.

1.5. Сыворотку крови исследуют в течение 3 сут со дня взятия крови. В случае исследования сыворотки в более поздние сроки ее замораживают или консервируют путем добавления мертиолата натрия до концентрации 1:10000.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Метод выделения вируса

Сущность метода заключается в выделении вируса на эмбрионах кур и последующей его идентификации.

2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Термостат с температурой нагрева 37-38 °С.

Центрифуга с частотой вращения 3000ГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа.

Центрифужные стаканы вместимостью 50-100 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа.

Весы лабораторные с погрешностью взвешивания не более 0,1 г.

Размельчитель тканей.

Овоскоп.

Колбы конические стеклянные вместимостью 100 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа по ГОСТ 1770.

Пробирки стеклянные вместимостью 10, 15, 20 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа по ГОСТ 25336.

Пипетки пастеровские или пипетки стеклянные измерительные вместимостью 1, 2, 5 и 10 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа по ГОСТ 20292.

Ступка фарфоровая.

Шприцы с иглами.

Стекло кварцевое.

Натрий хлористый по ГОСТ 4233, раствор с массовой долей 0,8% или другие дезинфицирующие средства.

Натрий лимонно-кислый 3-х замещенный по ГОСТ 22280, раствор с массовой долей 5%.

Йод по ГОСТ 4159, раствор с массовой долей 5% на физиологическом растворе.

Антибиотики - пенициллин и стрептомицин.

Среды питательные МПБ и МПА.

Парафин.

Развивающиеся эмбрионы кур 9-10-суточного возраста.

Эритроциты кур на физиологическом растворе, 0,7 и 1%-ная взвесь, которую готовят следующим образом: кровь берут у петухов или кур в возрасте старше 6 мес из подкрыльцовой вены в колбу с физиологическим раствором в равных объемах с раствором лимонно-кислого натрия.

Полученную кровь трижды отмывают физиологическим раствором, осаждая эритроциты центрифугированием с частотой вращения 1500ГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа в течение 10 мин. Из осадка эритроцитов готовят 0,7 или 1%-ную суспензию на физиологическом растворе и хранят не более 5 сут при температуре 4 °С.

2.1.2. Подготовка к исследованию

2.1.2.1. Обработка органов патологического материала

Патологический материал стерильно извлекают из глицеринового раствора, трехкратно ополаскивают стерильным физиологическим раствором и гомогенизируют с помощью размельчителя тканей или размельчают в ступке с кварцевым стеклом. Гомогенат разводят 1:10 стерильным физиологическим раствором и центрифугируют с частотой вращения 1500-2000ГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа в течение 15 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильные пробирки, добавляют 1000 ед/смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа стрептомицина и выдерживают при комнатной температуре 60 мин.

2.1.3. Проведение исследования

Для исследования одной пробы материала (надосадочная 10%-ная суспензия) заражают не менее 10 эмбрионов. Перед заражением эмбрионы предварительно овоскопируют, отмечая границу пуги и участок между кровеносными сосудами для прокола скорлупы и инокуляции исследуемого материала. Скорлупу со стороны пуги и место прокола дезинфицируют раствором йода и фламбируют. В центре воздушного пространства и в месте введения исследуемого материала делают пробойником отверстия, затем через боковое отверстие вводят 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа исследуемого материала на глубину 2-3 мм в аллантоисную полость. Одновременно делают его высевы по 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа на питательные среды МПБ и МПА, которые помещают в термостат при 37-38 °С. Контролем служат 5 незараженных эмбрионов. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заливают парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубируют в термостате в течение 24-96 ч при температуре 37-38 °С и относительной влажности 60-70%. В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют два раза в сутки, погибшие - сохраняют в холодильнике при 4 °С. Через 96 ч инкубации все эмбрионы вскрывают после предварительного охлаждения в холодильнике при 4 °С в течение 10-12 ч.

Перед вскрытием эмбрионов скорлупу обрабатывают йодом и фламбируют и из каждого эмбриона отдельно собирают экстраэмбриональную жидкость в стерильные пробирки, которую высевают на МПБ и МПА и проверяют на гемагглютинирующую активность вируса в капельной реакции гемагглютинации (РГА). Реакцию ставят на стекле путем смешивания равных капель экстраэмбриональной жидкости с 1%-ной взвесью эритроцитов кур. При отрицательной РГА образцы экстраэмбриональной жидкости в количестве 1-2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа от каждого зараженного эмбриона (не менее 5 эмбрионов) объединяют и вновь заражают не менее 10 эмбрионов.

Выделение вируса проводят в течение 3-х пассажей на куриных эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональную жидкость на наличие гемагглютининов в капельной РГА. Если титры гемагглютининов низкие, проводят еще 2-3 дополнительных пассажа.

2.1.4. Обработка результатов

Результат исследования пробы патологического материала считают отрицательным, если в трех дополнительных пассажах не будет обнаружено гемагглютинации эритроцитов.

При наличии гемагглютинации эритроцитов проводят идентификацию выделенного вируса.

2.2. Метод постановки реакции гемагглютинации

Сущность метода заключается в способности вируса гриппа птиц агглютинировать эритроциты кур.

2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.2.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы - по п.2.1.1 и дополнительно:

микротитратор типа Такачи или аналогичный;

микропипетки;

панели из плексигласа.

2.2.2. Проведение исследования

Готовят двукратные разведения вирусосодержащего материала (надосадочную жидкость, полученную после обработки патологического материала, как указано в п.2.1.2.1.) от 1:2 до 1:1024. Для этого в ряд лунок панелей из плексигласа наливают физиологический раствор в объеме 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа. В первую лунку вносят 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа вируса, трехкратно пипетируют и переносят 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа во вторую лунку и т.д. до требуемого разведения. Из последней лунки 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа удаляют в дезинфицирующий раствор. В каждую лунку добавляют по 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин.

Контролем служат две лунки с эритроцитами и физиологическим раствором в равных объемах по 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа каждого. Реакцию гемагглютинации и реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) ставят также с использованием микротитраторов или микропипеток в объеме 0,025 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа в плексигласовых панелях с лунками с 0,7%-ной суспензией эритроцитов.

2.2.3. Обработка результатов

Наличие на дне и стенках лунок осадка эритроцитов в виде опрокинутого "зонтика" свидетельствует о положительной РГА. При отрицательной реакции в опыте и контроле эритроциты образуют на дне лунки диск с ровными краями.

Титром вируса считают предельное разведение его, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов, что соответствует одной агглютинирующей единице (1 АЕ).

2.3. Метод идентификации вируса

Сущность метода заключается в способности специфических антител нейтрализовать гемагглютинирующую активность вируса в реакции торможения гемагглютинации со специфическими гриппозными сыворотками.

2.3.1. Аппаратура, материалы и реактивы

2.3.1.1. Аппаратура, материалы и реактивы - по п.2.2.1 и дополнительно:

набор сухих инактивированных антигенов вируса гриппа тринадцати серологических вариантов и гипериммунных сывороток для диагностики гриппа птиц;

аппарат Киппа;

баня водяная;

мел или мрамор;

кислота соляная по ГОСТ 3118 с массовой долей 30%.

2.3.2. Проведение исследования

После определения титра исследуемого вируса в количественной РГА по п.2.2.1 ставят РТГА. Вначале устанавливают рабочую дозу вируса (4 АЕ), для чего вирус разводят физиологическим раствором во столько раз, сколько получится от деления на 4 обратного значения гемагглютинирующего титра вируса. Например: если титр вируса 1:256, то рабочее разведение будет 256:4=64, т.е. в 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа разведенного 1:64 вируса будет содержаться 4 АЕ. Для его приготовления в данном примере берут 63 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа физиологического раствора и 1 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа исходного вируса.

Перед постановкой основного опыта проверяют правильность выбора 4 АЕ. Для этого на панели в четыре лунки наливают по 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа физиологического раствора, затем в первую лунку добавляют 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа 4 АЕ вируса и после пипетирования 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа переносят во вторую лунку, затем в третью и т.д. Из четвертой лунки 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа разведенного вируса удаляют в дезинфицирующий раствор. Таким образом, в первой лунке должно быть 2 АЕ, во второй - 1 АЕ, в третьей - 0,5 АЕ, в четвертой - 0,25 АЕ. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа 1%-ной суспензии эритроцитов. Панель встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. При правильном определении рабочей дозы (4 АЕ) в первой и второй лунках должна быть полная агглютинация, в третьей - частичная агглютинация, в четвертой - четко выраженный диск ("пуговица") осевших эритроцитов.

Если в третьей лунке оказывается полная агглютинация, то это означает, что выбранная доза вируса содержит не 4 АЕ, а больше. В этом случае доза должна быть уменьшена. И наоборот, отсутствие агглютинации во второй и частично в третьей лунках свидетельствует о недостаточности вируса. Увеличивают или уменьшают рабочую дозу, добавляя соответственно вирус или физиологический раствор и затем повторно проверяют правильность выбора 4 АЕ.

2.3.3. Для постановки основного опыта в ряд лунок, начиная со второй, наливают по 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа физиологического раствора. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа специфической сыворотки. Во второй лунке смесь пипетируют и переносят 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа в третью лунку и т.д. до требуемого разведения. После этого во все лунки вносят по 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа рабочего разведения вируса (4 АЕ). Панели встряхивают и после 30-минутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа 1%-ной суспензии эритроцитов.

Для точности учета РТГА ставят контроль:

сыворотки (0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа сыворотки + 0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа физиологического раствора и 0,4 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа 1%-ной суспензии эритроцитов);

эритроцитов на спонтанную агглютинацию (0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа физиологического раствора ±0,2 смГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа 1%-ной суспензии эритроцитов).

2.3.4. Обработка результатов

РТГА считают положительной, а идентификацию вируса завершенной, если специфическая сыворотка тормозит гемагглютинирующую активность вируса не менее 1/4-1/8 титра, указанного на этикетке ампулы (флакона).

2.4. Метод выявления специфических антител

Сущность метода заключается в обнаружении специфической способности антител сыворотки крови больных и переболевших птиц подавлять гемагглютинирующую активность вируса в РТГА. С этой целью исследуют в РТГА с диагностическими антигенами вируса гриппа не менее 20 проб сыворотки крови от каждой обследуемой партии птиц.

2.4.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - по пп.2.1.1, 2.3.1 и дополнительно:

глицерин,

лед сухой.

2.4.2. Подготовка к исследованию

Исследуемые сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 дистиллированной водой. Для удаления термолабильных ингибиторов сыворотки прогревают в водяной бане при 60 °С в течение 30 мин. В ампулы (флаконы) с антигенами добавляют физиологический раствор (рН 7,2-7,4) согласно "Наставлению по применению набора антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц".

2.4.3. Проведение исследования

Вначале готовят двухкратное разведение сыворотки на физиологическом растворе, начиная с разведения 1:5. Далее ставят РТГА, как указано в п.2.3.

При обнаружении в сыворотке крови титров антител 1:10 и выше, ее освобождают от неспецифических термостабильных ингибиторов с целью подтверждения наличия специфических антител к вирусу гриппа. Для удаления термостабильных ингибиторов через разведенную и прогретую сыворотку крови пропускают углекислый газ из аппарата Киппа или добавляют кусочки сухого льда. Обработку сыворотки ведут в течение 2-3 мин. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием в течение 10 мин с частотой вращения 1500ГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа. Надосадочную жидкость исследуют в РТГА.

2.4.4. Обработка результатов

Титром антител в сыворотке считают ее последнее разведение, давшее полную задержку гемагглютинации с исследуемым антигеном.

Выявление титра антител 1:10 и выше, но не менее, чем в 30% исследованной сыворотки является основанием для постановки диагноза, который должен быть подтвержден положительным результатом вирусологических исследований.

2.5. Метод ретроспективной диагностики

Сущность метода заключается в обнаружении достоверного прироста уровня специфических антител, обусловленного естественным развитием гриппозной инфекции в организме зараженных птиц.

2.5.1. Аппаратура, материалы и реактивы

Аппаратура, материалы и реактивы - по п.2.2.1.1.

2.5.2. Проведение исследований

Исследуют парные сыворотки, полученные в первые 1-2 сут в начале заболевания и через 4-10 сут после первого взятия крови. Сыворотку крови освобождают от ингибиторов как указано в п.2.4. РТГА ставят с выделенным вирусом или с антигенами диагностического набора по пп.2.3 и 2.4 с учетом эпизоотической обстановки по циркуляции того или иного серологического варианта вируса гриппа.

2.5.3. Обработка результатов

Четырехкратное и более увеличение титров антител в парных сыворотках является основанием для установления положительного диагноза.



Последние документы

Copyright © 2017